Identification des régulateurs clés d’un réseau de gènes associé à l’épilepsie – EpiReg

Dans le premier lot de travail qui visait à valider in vivo l'effet protecteur de la withaferine A (WFA) contre l'épilepsie, le protocole expérimental initialement prévu sur un modèle d'épilepsie du lobe temporal chez le rat a dû être transféré à un autre modèle animal (le poisson zèbre) en collaboration avec l'équipe du Dr Nadia Soussi-Yanicostas. La susceptibilité aux crises induites par le pentylènetétrazole (PTZ) chez le poisson zèbre a été estimée par un système d'enregistrement automatisé sur 4 groupes de 240 embryons pour comparer les embryons exposés ou non au PTZ avec ou sans pré-traitement de 24h par la WFA.

Le deuxième lot de travail du projet EpiReg visait à identifier le(s) régulateur(s) du réseau de gènes M30. Ce deuxième lot de travail a été élargi en ajoutant aux deux tâches déjà prévues (1 et 2) deux autres nouvelles tâches (3 et 4) :

(1) la cartographie de régulateur(s) clé(s) candidat(s) de M30 a été réalisée en utilisant un modèle de régression Bayesien pour tester l'association des variations de type SNP à l'échelle du génome entier avec le niveau d'expression des gènes M30. Les jeux de données utilisés pour ces analyses sont : celui qui avait permis l’identification de la Sestrin 3 comme régulateur clé d’un réseau associé à l’épilepsie (Jonhson et al. 2015 Nature Communcations, n=129; et celui du Consortium United Kingdom Brain Expression UKBEC, n=88).

(2) Des morpholinos dirigés contre le gène régulateur clé sélectionné ont été synthétisés. Le comportement des larves dans lesquelles le gène régulateur clé est invalidé par injection de morpholino a été analysé en mesurant les mouvements capturés par un système d'enregistrement automatisé et en comparant à des témoins pour une centaine de larves dans chaque condition. L’activité neuronale calcique a été imagée, quantifiée et comparée à des témoins sur une plus petit nombre larves (4-5 par condition).

(3) De nouvelles méthodes de modélisation de la dynamique d’un réseau de régulation génique sous forme de réseau booléen et d’identification de régulateurs clés ont été développées et affinées à partir de M30. Les algorithmes développés ont été diffusés sous forme d'un package réutilisable et généralisable à d’autres réseaux de gènes et à d’autres maladies.

(4) Nous avons adapté le plan expérimental prévu sur le modèle d’épilepsie du lobe temporal chez le rat avec un protocole plus court et sans chirurgie pour générer de nouveaux jeux de données de transcriptome spatial (Visium, 10X Genomics) et sur noyaux uniques à différents temps de la phase d'épileptogénèse à partir de coupes de cerveaux centrées sur l'hippocampe.

Les travaux expérimentaux sur la withaferine A comme médicament neuroprotecteur anti-épileptique ont finalement été réalisés sur le poisson zèbre. L'étude de la susceptibilité aux crises induites par le pentylènetétrazole (PTZ) estimée en fonction de la distance nagée par les larves détectée grâce à un système d'enregistrement automatisé a montré une diminution significative de l'effet du PTZ sur les larves prétraitées à la WFA, mais aussi une hyperexcitabilité des larves non exposées au PTZ quand prétraitées avec la WFA par rapport aux témoins. Malgré la publication par une équipe corréenne dès 2020 de données confortant un effet neuroprotecteur de la WFA pendant l’epileptogénèse dans l’hippocampe (Zhu et al Epilepsy Research 2020) les résultats mitigés obtenus chez le poison zèbre nous ont amené à recentrer nos efforts le deuxième lot de travail du projet EpiReg.

La cartographie de régulateurs clé de M30 avait identifié plusieurs loci candidats à partir du jeu de données issus de patients atteints d'épilepsie du lobe temporal préalablement utilisé pour l'identification de la Sestrin 3 (Jonhson et al 2015 Nature Communications). Aucun des loci candidats n'a pu être confirmé sur le jeu de données du consortium UKBEC.

De nouvelles méthodes de modélisation de la dynamique d’un réseau de régulation génique sous forme de réseau booléen et d’identification de régulateurs clés ont été développées et affinées à partir de M30 dans le travail de doctorat de Clémence Réda (https://theses.fr/2022UNIP5057). Ces résultats ont été présentés lors de conférences internationales (AISTATS 2021, CSBM 2022 and SMPGD 2023) et ont été publiés dans les “proceedings” de ces conférences (http://proceedings.mlr.press/v130/reda21a/reda21a.pdf; link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-031-15034-0_5). Les algorithmes développés ont été diffusés sous forme d'un package en langage python de façon à être réutilisable et généralisable à d’autres réseaux de gènes et à d’autres maladies. Ils sont publiés en accès libre (NORDic: a Network-Oriented package for the Repurposing of Drugs. pypi.org/project/NORDic/2.2.6/ disponible sur Github github.com/clreda/NORDic et dans le Journal of Open Source Software en 2023 doi.org/10.21105/joss.05532)

L'étude chez le poisson zèbre de l'invalidation par morpholino du gène régulateur clé de M30 sélectionné en utilisant la nouvelle suite de méthodes a confirmé son rôle majeur pour l'homéostasie neuronale cérébrale.

De nouveaux jeux de données de transcriptome spatial (Visium, 10X Genomics) et sur noyaux uniques à différents temps de l'épileptogénèse ont été générés sur le modèle d'épilepsie du lobe temporal chez le rat à partir de coupes de cerveaux centrées sur l'hippocampe. Les résultats ont été présentés en poster lors de la conférence européenne de biologie computationelle en Finland à Turku en septembre 2024 et font l'objet d'un article en préparation.

Le projet EpiReg a permis le développement et la diffusion d'une nouvelle suite de méthodes appelée NORDic généralisable à d'autres réseaux que M30 et à d'autres maladies. Les travaux sur identification de médicaments ou molécules candidates pour cibler les dérégulations d'un réseau de régulation génique et rétablir un état "sain" ou "normal" de l'expression des gènes se poursuivent. L'expertise développée par les membres de l'équipe qui ont travaillé sur le projet EpiReg a abouti à de nouveaux projets et à de nouveaux financements pour l'équipe et pour ses membres.

Les analyses de réseaux de régulations géniques pour l'identification de cibles thérapeutiques ou le repositionnement de médicament pour diminuer le risque de syndrome de stress post-traumatique après l'hospitalisation d'un proche en réanimation est une des tâches prévues dans le projet RHU FAME.

Le Dr Clémence Réda a elle aussi poursuivi dans la direction de l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques. Son travail post-doctoral en Allemagne vise à l'amélioration de méthodes de criblage de médicaments ou molécules candidates (bourse européenne Marie Sklodowska Curie, projet RECeSS, cordis.europa.eu/project/id/101102016). Elle vient d'être reçue aux concours d'entrée du CNRS sur un poste de chargé de recherche qui va débuter cet automne 2024 dans l'équipe d'Auguste Genovesio du centre de biologie computationnelle de l'Institut de Biologie de l'Ecole Normale Supérieure.

Les données nouvellement générées par le projet EpiReg durant l'épileptogénèse constituent un jeu de données unique et précieux. Au délà de leur intérêt pour explorer la dynamique des réseaux de régulation génique lors de la mise en place d'une épilepsie chronique après un état de mal induit par une injection de pilocarpine, les possibilités d'exploitation et de valorisations sont multiples.

Delahaye-Duriez A, Réda C, Gressens P. [Identification of therapeutic targets and drug repurposing via gene network analysis]. Med Sci (Paris). 2019 Jun-Jul;35(6-7):515-518. doi:10.1051/medsci/2019108. Epub 2019 Jul 5. French.

Réda C, Kaufmann E, and Delahaye-Duriez A. Machine learning applications in drug development. Comput. Struct. Biotechnol. J. 2020 doi:10.1016/j.csbj.2019.12.006. [Epub ahead of print] hal.inria.fr/hal-02533303/

L’épilepsie est une maladie neurologique grave qui se caractérise par une récurrence non provoquée de crises convulsives. La biologie des systèmes et les analyses de réseaux de gènes constituent des approches puissantes pour étudier les voies moléculaires impliquées dans l’épilepsie. Elles ont aussi déjà permis de pointer de nouvelles cibles thérapeutiques. Le Dr Delahaye a participé à l’identification du réseau de gènes M30 pour lequel converge une association aux formes communes et rares d’épilepsie. Le réseau M30 se compose de 320 gènes largement exprimés dans le cerveau humain sous un contrôle étroit pendant le développement. Ces gènes codent principalement pour des protéines qui interagissent entre elles et qui sont impliquées dans des processus synaptiques. L’hypothèse principale du projet EpiReg est qu’en ciblant ce réseau de gènes on pourrait développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Comme preuve de concept, nous avons démontré à partir du jeu de données “Connectivity map” (CMap), que parmi les médicaments capables d'induire des changements du niveau d'expression sur les lignées cellulaires, l'acide valproïque (VPA), un médicament anti-épileptique largement utilisé avec un large spectre d'efficacité, est celui qui est prédit le plus significativement pour restaurer l'expression de M30 vers un état non épileptique. Le dépistage systématique de médicaments en fonction de leur effet mesuré sur l'expression des gènes a également prédit que la withaferine A (WFA) inverse les changements d'expression de M30 associés à l'épilepsie.
La première partie du projet EpiReg vise à valider in vivo dans un modèle d'épilepsie de rat cette approche de selection in silico de médicament candidat. Les enregistrements des élecroencephalogrammes de rats épileptiques exposés à la WFA et à la VPA seront étudiés ainsi que le transcriptome à partir de leurs hippocampes. La deuxième partie du projet EpiReg vise à identifier le(s) régulateur(s) du réseau de gènes M30 en utilisant des approches innovantes de génétique des systèmes, puis de les valider in vivo sur un modèle poisson-zèbre.
Le projet EpiReg générera de nouveaux jeux de données d'expression associées à des données fonctionnelles et phénotypiques pour plusieurs modèles animaux. La validation in vivo de la WFA comme médicament anti-épileptique et l'identification de régulateur(s) génétique(s) primaire(s) du réseau de gènes associé à l'épilepsie M30 apporteront des orientations claires pour le développement de nouveaux médicaments contre l’épilepsie.