Composition, stoichiométrie, dynamique et organisation spatiale de la voie de costimulation CD28 dans des lymphocytes T primaires stimulés de manière physiologique – SUPER-BASILIC

Bien que le récepteur pour l'antigène des lymphocytes T occupe une place centrale dans la physiologie des cellules T, il ne fonctionne pas isolément et les signaux qu'il délivre sont renforcés par ceux de molécules co-stimulatrices comme CD28. Nous avons récemment identifié une nouvelle protéine intracytoplasmique appelée RLTPR et dont l’importance fonctionnelle montre que la complexité du réseau de signalisation CD28 est plus élevé qu'on ne le pensait à l'origine. L'objectif du présent projet multidisciplinaire est donc d'élucider la composition, la dynamique et, surtout, l'organisation spatiale de la voie co-stimulatrice CD28 de cellules T primaires lorsque déclenchée par des stimuli physiologiques. L'hypothèse à la base du présent projet est qu'en établissant par purification d’affinité et spectrométrie de masse (AP-MS) la composition, la stoechiométrie et la dynamique des complexes de signalisation (signalosomes) s'assemblant autour des noeuds de signalisation CD28 et RLTPR, nous dévoilerons les circuits de signalisation moléculaire utilisés par CD28, un déclencheur clé de l'immunité adaptative. Cependant, pour aller au-delà d’une «collection de timbres», il est essentiel de décrire l’organisation spatiale des interactions protéine-protéine documentées au travers des approches d’interactomique. Par conséquent, une grande partie du présent projet sera consacrée à établir une vision à la fois statique et dynamique décrivant à l’échelle d’une cellule individuelle l'organisation des principales interactions protéine-protéine impliquées dans la signalisation CD28 avec une résolution spatiale et temporelle élevée, et à en comprendre leurs évolutions à la suite de l'engagement de CD28. Ceci est crucial dans la mesure où l'AP-MS nécessite l'analyse simultanée d'un grand nombre de cellules T et ne fournit donc qu'une vue ‘moyennée’ de la composition et de la dynamique des signalosomes. La validation des cartes spatiotemporelles résultantes et des relations de causalité inférées sera réalisée par l'intermédiaire de technique d’édition génique accélérée dans les cellules T primaires.
La nouveauté méthodologique du projet provient (1) de sa nature pluridisciplinaire, (2) de son utilisation de cellules T primaires (non transformées), (3) de sa capacité à sonder par AP-MS l'architecture et la dynamique des nœuds de signalisation CD28 et RLTPR, (4) de l'attention portée à la stoechiométrie des signalosomes étudiés, un paramètre clé largement ignoré dans les études précédentes, et (5) de la détermination à l’échelle cellulaire des relations spatio-temporelles existant entre les interactions moléculaires identifiées par AP-MS. Ce dernier aspect est basé sur la possibilité de localiser une seule molécule par une technique de microscopie appelée SMLM et une stratégie intégrée impliquant une cryo-immobilisation rapide des échantillons et des algorithmes conçus pour produire des analyses quantitatives robustes. Le «grand final» de notre projet consistera à intégrer l’ensemble des observations effectuées à plusieurs échelles afin de proposer un modèle complet de la voie de signalisation CD28. Bien que de nature fondamentale et destiné à comprendre au niveau systémique la complexité d'un déclencheur clé de l'immunité adaptative, notre projet offre des perspectives thérapeutiques claires puisqu'il devrait améliorer la conception rationnelle des immunothérapies ciblant les costimulateurs.