Identification des facteurs mécanobiologiques mis en jeu lors de la formation des plaquettes – PlatForMechanics

Tâche 1. Ressenti de la rigidité par les MKs.
Des analyses in vitro sont effectuées en utilisant des MK différenciés in vitro à partir de progéniteurs Lin-, pendant 3 jours. Les cellules sont déposées sur un substrat recouvert de fibronectine avec une rigidité allant de <1kpa à >90 kpa. La capacité d'adhésion est déterminée après 2h, l'étendue de l'étalement après 5h, et la capacité de formation de plaquettes après 24h. Le type d'adhérence est analysé à l'aide d'anticorps dirigés contre les intégrines et les composants du complexe d'adhérence focale. Des expériences pour mesurer la force de traction seront effectuées. Des analyses transcriptomiques ont été effectuées avec des MKs adhérés sur des matrices molles (<1kPa) et rigides (90 kPa). Enfin, le comportement des MKs provenant de souris WT ou de souris déficientes pour les récepteurs mécanosensibles est comparé.
Tâche 2 : Déchiffrer les voies de mécanotransduction.
Les voies de mécanotransduction sont évaluées en déterminant la relocalisation des facteurs de transcription mécanosensibles (MKL1, Yap, Taz) et l'implication potentielle des petites Rho GTPases lors de l'adhésion sur la surface de différentes rigidités. Des souris knockout Piezo1/2 et Yap/Taz sont étudiées en ce qui concerne leur capacité de formation de (pro)plaquettes à l'état homéostatique et dans les conditions suivantes : régénération de la moelle osseuse (5-FU, TPO), nombre de MK, ploïdie et ultrastructure.

âche 1. Ressenti de la rigidité par les MKs.
Des analyses in vitro sont effectuées en utilisant des MK différenciés in vitro à partir de progéniteurs Lin-, pendant 3 jours. Les cellules sont déposées sur un substrat recouvert de fibronectine avec une rigidité allant de <1kpa à >90 kpa. La capacité d'adhésion est déterminée après 2h, l'étendue de l'étalement après 5h, et la capacité de formation de plaquettes après 24h. Le type d'adhérence est analysé à l'aide d'anticorps dirigés contre les intégrines et les composants du complexe d'adhérence focale. Des expériences pour mesurer la force de traction seront effectuées. Des analyses transcriptomiques ont été effectuées avec des MKs adhérés sur des matrices molles (<1kPa) et rigides (90 kPa). Enfin, le comportement des MKs provenant de souris WT ou de souris déficientes pour les récepteurs mécanosensibles est comparé.
Tâche 2 : Déchiffrer les voies de mécanotransduction.
Les voies de mécanotransduction sont évaluées en déterminant la relocalisation des facteurs de transcription mécanosensibles (MKL1, Yap, Taz) et l'implication potentielle des petites Rho GTPases lors de l'adhésion sur la surface de différentes rigidités. Des souris knockout Piezo1/2 et Yap/Taz sont étudiées en ce qui concerne leur capacité de formation de (pro)plaquettes à l'état homéostatique et dans les conditions suivantes : régénération de la moelle osseuse (5-FU, TPO), nombre de MK, ploïdie et ultrastructure.

Les mégacaryocytes sont de véritables cellules mécanosensibles et, en adhérant à la fibronectine, l'intégrine b3, mais pas b1, jouerait le rôle de mécanorécepteur. La manière dont cette interaction module la signalisation intracellulaire est actuellement en cours d'évaluation.
Yap et Taz pourraient être impliqués dans la régulation négative de la formation de plaquettes lors de la régénération de la moelle après une myéloablation.

Présentation orales:
Thao Nguyen, Alicia Bornert, Christian Gachet, François Lanza, Catherine Léon. Integrin ß3 regulates fibronectin rigidity sensing by megakaryocytes and proplatelet formation. 2nd Mechanobiology meeting in Vietnam: when physics meets biology. Quy Nhon, Vietnam, 2019

Thao Nguyen, Alicia Bornert, Christian Gachet, François Lanza, Catherine Léon. L’intégrine ß3 régule la sensibilité des mégacaryocytes à la rigidité du substrat et leur capacité à former des proplaquettes. Club Français des Plaquettes et Mégacaryocytes. Toulouse 2019

Les plaquettes sanguines jouent un rôle essentiel dans la vie quotidienne en prévention des hémorragies. Une diminution du nombre de plaquettes à la suite d’un traumatisme, d’une chimiothérapie ou de maladie héréditaire est une menace pour la vie des patients. La transfusion plaquettaire est la seule option thérapeutique dans la plupart des cas. Le vieillissement de la population et l'augmentation des chimiothérapies agressives entrainent un accroissement de la demande qui pourrait conduire à des situations de pénurie. A l'heure actuelle, la disponibilité en plaquettes dépend exclusivement des donneurs, à quoi s’ajoutent un temps de conservation limité et des préoccupations sécuritaires concernant la qualité des produits et les risques immunologiques et infectieux. C’est pourquoi la production de plaquettes in vitro a attiré beaucoup d'attention au cours de la dernière décennie et représente un enjeu à la fois thérapeutique et économique majeur. Pourtant, malgré les efforts déployés par plusieurs laboratoires, les rendements des plaquettes générées in vitro restent insuffisants pour offrir une alternative réaliste à la transfusion.
Les plaquettes sont naturellement produites dans la moelle osseuse par les mégacaryocytes (MKs), cellules dérivant de la différenciation de cellules souches hématopoïétiques puis de leur maturation. Aux stades matures, les MKs étendent des proplaquettes, longues extensions à travers la paroi des vaisseaux sanguins avant d'être libérées sous forme de plaquettes. Aujourd'hui, bien que l’on sache cultiver les MKs in vitro en milieu liquide, leur maturation n’est pas optimale, en raison notamment d’un manque de connaissances concernant les mécanismes in vivo. Notre projet vise à comprendre le rôle de l’environnement dans la différenciation/maturation des MKs, en nous attachant aux composantes physiques et mécaniques à travers l’interaction avec la matrice. La moelle est un tissu peu rigide, mais où le confinement génère des contraintes mécaniques fortes pendant les étapes de maturation, puis très faible au cours de la libération des plaquettes dans le sang. Pourtant, l’impact de ces forces dans la formation des plaquettes est peu étudié. Nos travaux ont récemment montré que la culture en milieu semi-rigide 3D améliore la maturation des MKs et la formation des proplaquettes par rapport au milieu liquide. Dans la suite logique de ces travaux, nous voulons maintenant établir comment les MKs ressentent ces forces (étude des mécanorécepteurs intégrines et Piezo) et s’y adaptent (mécanotransduction et rôle de MKL1 et YAP/TAZ) pour optimiser la formation des plaquettes via un remodelage de l’architecture des MKs. Ce travail est guidé par des données préliminaires non publiées montrant que 1) les MKs forment préférentiellement des proplaquettes sur des surfaces semi-rigides, 2) les intégrines et récepteurs Piezo régulent la formation des plaquettes in vivo, 3) les facteurs de transcription MKL1 et YAP sont activés lorsque les MKs sont cultivés en milieu semi-rigide.
Le projet repose sur des connaissances et des approches complémentaires des trois partenaires, d’une part des experts en biologie des MKs et d’autre part un expert en mécanobiologie. Ce projet combine des techniques d'imagerie microscopiques innovantes (confocale/intra-vitale en bi-photon/électronique à transmission) et des approches de (mécano)biologie cellulaires (adhésion sur surface de rigidité variable, micropatterns, mesure de force de traction) et moléculaires (transcriptome, signalisation, transduction de cellules primaires). La force de ce projet est de pouvoir associer des études in vitro et in vivo, dans des systèmes biologiques murins et humains. Il apportera une compréhension sur des mécanismes jusque-là négligés et pourtant mis en jeu lors d’étapes clés de la biogénèse des plaquettes. Les données obtenues pourront générer de nouvelles stratégies pour améliorer la production de plaquettes à visée transfusionnelle.