Prévenir les interactions protéines-protéines pour restaurer le défaut fonctionnel de F508del-CFTR. – CFTRgateway

L’interactome du canal CFTR normal et muté est réalisé par marquage de proximité couplé à la spectrométrie de masse. Cette nouvelle technologie est adaptée à l’étude des protéines transmembranaires comme CFTR. Nous avons évalué deux méthodologies en fusionnant sur CFTR soit APEX2 soit TurboID et vérifié que les caractéristiques du canal n’étaient pas modifiées. Ces enzymes ajoutent sur le partenaire un groupement phenol-biotine (APEX2) ou biotine (TurboID) permettant de les purifier avec des billes de streptavidine puis de les identifier par la spectrométrie de masse. Ces procédures permettent d’identifier environ 1000 partenaires de CFTR, avec environ 50% de protéines communes aux deux méthodes. La comparaison de la protéine normale avec des mutants de CFTR a conduit à (i) l’identification d’un mutant atypique partiellement présent à la surface, (ii) des partenaires impliqués dans la dégradation de CFTR, sa stabilité à la surface des cellules et (iii) des partenaires non-restaurés par les traitements actuels. L’implication dans la biogénèse ou l’activité de CFTR d’environ 50 partenaires identifiés a été évalué sur CFTR normal et muté en combinaison avec les modulateurs de CFTR.

Le projet a permis de mettre en place une méthodologie pour identifier des partenaires protéiques de CFTR impliqué dans la mucoviscidose ainsi que de KCNK3 impliqué dans l’hypertension artérielle. Il identifie l’interaction CFTR-PRAF2 comme une cible du correcteur VX-445 ce qui lève la rétention de la protéine mutée dans le réticulum endoplasmique, identifie un mutant atypique présent à la surface et des partenaires impliqués dans la dégradation de CFTR ou modulant sa stabilité à la surface des cellules qui représentent des cibles permettant d’augmenter l’efficacité des traitements actuels.

Ce projet a permis de mettre en place une nouvelle méthodologie pour identifier des partenaires protéiques de CFTR impliqué dans la mucoviscidose.

Cette méthodologie permet d’identifier un défaut atypique induit par la mutation N1303K améliorant le traitement de cette mutation, de mieux définir le mécanisme d’action du correcteur VX-445 qui pourrait s’appliquer à d’autres protéines ayant des motifs RXR, d’identifier des partenaires de CFTR impliqués dans l’ubiquitination de la protéine mutée ou modulant la stabilité à la surface. L’inhibition de certains partenaires pourrait donc augmenter la correction de CFTR avec les correcteurs VX-661 et VX-445 en combinaison avec le potentiateur VX-770 (traitement Trikafta efficace chez les patients), traitement qui ne corrige pas tous les défauts associés à F508del. Parmi les partenaires identifiés, ceux impliqués dans la dégradation de CFTR (e.g. ubiquitination) ou modulant sa stabilité à la surface des cellules (e.g. CAL), représentent des cibles thérapeutiques permettant d’augmenter l’efficacité des traitements actuels. Cette méthodologie a également permis d’établir l’interactome du canal KCNK3 impliqué dans l’hypertension artérielle.

L’exploration des partenaires impliqués dans l’ubiquitination de CFTR sera poursuivie afin d’augmenter la stabilité de CFTR corrigé. La diminution de l’ubiquitination de CFTR à une étape précoce permettrait d’augmenter l’efficacité des correcteurs, de stabiliser la protéine à la surface et de restaurer l’interactome notamment avec les transporteurs SLC.
La stabilisation de CFTR à la surface est un enjeu important pour augmenter l’efficacité des traitements actuels. Dans le cadre de l’ANR STABTHER (ANR-23-CE18-0003-01) portée par Magali Taulan (INSERM U1046, PhyMedExp, Université de Montpellier) et dans laquelle je suis partenaire, l’interaction CFTR-CAL sera ciblé au moyen de peptides.
Finalement, afin de mieux comprendre le mécanisme d’action de l’apigénine sur CFTR WT et N1303K, un projet IDEX a été déposé en collaboration avec Maria Miteva (INSERM U1268, UMR 8038 CNRS).

Ces nouvelles méthodes d’analyse ont été comparées et ont permis d’identifient de nouveaux partenaires de CFTR. Parmi les partenaires de CFTR, nous démontrons que PRAF2 est un acteur clef dans la rétention dans le réticulum endoplasmique et que l’interaction CFTR-PRAF2 est ciblée par le correcteur VX-445. Cette méthode identifie un mutant atypique présent à la surface permettant d’adapter le traitement et a été utilisé avec succès sur un autre canal impliqué dans l’hypertension artérielle.

Publications acceptées
Saha K, Chevalier B, Doly S, Baatallah N, Guilbert T, Pranke I, Scott MGH, Enslen H, Guerrera C, Chuon C, Edelman A, Sermet-Gaudelus I, Hinzpeter A*, Marullo S*. Pharmacological chaperone-rescued cystic fibrosis CFTR-F508del mutant overcomes PRAF2-gated access to endoplasmic reticulum exit sites. Cell Mol Life Sci. 2022 Sep 27;79(10):530.

Chevalier B, Baatallah N, Najm M, Castanier S, Jung V, Pranke I, Golec A, Stoven V, Marullo S, Antigny F, Guerrera IC, Sermet-Gaudelus I, Edelman A, Hinzpeter A. Differential CFTR-Interactome Proximity Labeling Procedures Identify Enrichment in Multiple SLC Transporters. Int J Mol Sci. 2022 Aug 11;23(16):8937.

Le Ribeuz H, Saint-Martin Willer A, Chevalier B, Sancho M, Masson B, Eyries M, Jung V, Guerrera C, Dutheil M, El Jekmek K, Laubry L, Carpentier G, Perez-Vizcaino F, Tu L, Guignabert C, Chaumais MC, Péchoux C, Humbert M, Hinzpeter A, Mercier O, Capuano V, Montani D and Antigny F. Role of KCNK3 Dysfunction in Dasatinib-Associated PAH and Endothelial Cell Dysfunction, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology (accepté le 04/03/2024)

Publication en reviewing
Pranke I*, Capurro V*, Chevalier B*, Pesce E*, Tomati V, Pastorino C, Hatton A, Urien S, Lena M, Dréano E, Bocciardi R, Zara F, Pantano S, Terlizzi V, Lucanto C, Costa S, Claut L, Daccò V, Poli P, Maschio M, Fabrizzi B, Caporelli N, Cipolli M, Volpi S, Jung V, Roger K, Chedevergne F, Cosson L, Macey J, LeBihan J, Weiss L, Grenet D, LeClainche Viala L, Douvry B, Ravoninjatovo B, Audousset C, Tatopoulos A, Richaud Thiriez B, Baravalle M, Thouvenin G, Labbé G, Mittaine M, Reix P, Durieu I, Mankikian J, Bui S, Kelly-Aubert M, Nguyen–Khoa T, Khoukh K, Martin C, Guerrera C, Da Silva J, di Carli P, Castellani C, Cresta F, Galietta L, Guillemaut A, Bouazza N, Girodon E, Remus N, Burgel PR, Sermet-Gaudelus I#, Hinzpeter A#, Pedemonte N (*: co-first and #: co-last)
Beyond Kaftrio: mechanistic insights to maximize N1303K-CFTR rescue

Les maladies liées au repliement des protéines (PMD) sont associées soit à l'agrégation toxique de protéines mal repliées, soit à une dégradation des protéines conduisant à une perte de fonction. La mucoviscidose est un exemple d’une maladie de perte de fonction résultant de mutations génétiques au sein du canal chlorure CFTR, F508del étant de loin la mutation la plus fréquente. Cette mutation induit un mauvais repliement de la protéine, à une réduction de l’activité du canal chlorure CFTR et à une instabilité de la protéine à la membrane plasmique (MP). La maturation des canaux mutants peut être partiellement rétablie par des petites molécules appelées correcteurs, tandis que la fonction peut être améliorée par des molécules dites potentialisatrices. Cependant, cette combinaison n’est pas optimale dans les essais cliniques et il n'y a toujours aucun moyen d'augmenter la stabilité de la protéine mutée à la MP.
Cibler des interactions intracellulaires protéine-protéine dans lesquelles la protéine anormalement repliée est engagée pourrait augmenter l’activité et/ou le nombre de canaux CFTR à la MP. Cette hypothèse est confortée par les résultats de nos travaux précédents montrant qu'une interaction avec le filament intermédiaire Keratin 8 retenait F508del-CFTR dans le réticulum endoplasmique (RE) et que la diminution de cette interaction augmentait l'expression fonctionnelle de CFTR-F508del. Ces recherches ont conduit à l'identification d'une nouvelle classe de correcteurs de CFTR. De nouvelles données préliminaires indiquent aussi que les deux classes de correcteurs, ciblant soit CFTR directement soit ses interactions avec des partenaires protéiques, ont un effet additif.
Nos nouveaux résultats ont permis identifier PRAF2, une protéine résidente du RE comme un nouveau régulateur clé de la sortie du CFTR depuis ce compartiment, suggérant que l'interaction PRAF2 / F508del-CFTR pourrait être une nouvelle cible pour la pharmacothérapie. Nous avons pu démontrer que PRAF2 était un modulateur stœchiométrique de la sortie RE d'autres protéines transmembranaires et que cette régulation impliquait un code-barre moléculaire représenté par des motifs de type RXR portés par les domaines intra-cytoplasmiques des protéines en cours de transport. Un objectif de notre projet sera de comprendre le rôle de PRAF2 dans la sortie du CFTR depuis le RE en identifiant les motifs de liaison spécifiques et les acteurs moléculaires impliqués dans le transport ou la rétention. Ce travail servira de base à la mise en place d'un crible moléculaire ciblant l'interface PRAF2/CFTR.
En parallèle, nous identifierons de nouvelles protéines formant des complexes soit avec F508del-CFTR ou le CFTR normal (interactomique différentielle globale) et les partenaires du F508del-CFTR spécifiques de certaines organites/compartiments, le RE et la MP en particulier (interatomique différentielle locale). Nous utiliserons pour cela une nouvelle approche protéomique : marquage de proximité avec APEX2 et complémentation APEX2 couplées à la spectrométrie de masse. L'importance des nouveaux partenaires moléculaires sera évaluée sur le plan fonctionnel et biochimique.
Les meilleures cibles seront combinées avec les modulateurs CFTR disponibles aujourd'hui pour améliorer l'efficacité du traitement et testé sur les cellules épithéliales primaires.
Cibler des interactions protéine-protéine spécifiques peut conduire à la libération de protéines mal repliées partiellement fonctionnelles et restaurera une partie de l'activité fonctionnelle. Pour la mucoviscidose, cela pourrait constituer une amélioration thérapeutique en combinaison avec les modulateurs de CFTR disponibles. Les résultats de notre étude permettront de conforter la stratégie de cibler les interactions protéine-protéine dans les PMD et fourniront une méthode d’étude d'autres PMD avec perte de fonction comme le déficit en alpha-1-antitrypsine, syndrome néphrotique...