Etude des liens moléculaires entre la force du cytosquelette d’actomyosine, la régulation des intégrines et les propriétés de la matrice extracellulaire grâce à une reconstitution in vitro – RECAMECA

Nous reconstituons un complexe d’adhésion fait d’une membrane supportée contenant des intégrines qui relient des câbles d’actomyosine, via des protéines régulatrices, d’un côté, et une ECM microstructurée de l’autre côté. Le suivi en microscopie des trajectoires des molécules uniques des composants du système, où la concentration des composants, la force de l’actomyosine et les propriétés physiques de l’ECM sont modulables, identifie les réactions mécanosensibles. L’importance des découvertes est testée dans des cellules.

Le point central de ce projet est l'étude de la mécanosensibilité d'une adhérence focale artificielle. Nous avons commencé par purifier le récepteur transmembranaire intégrine pour établir notre système. Nous avons réussi à purifier l'intégrine alphaIIb beta3 des plaquettes que nous utiliserons d'abord comme modèle. Nous avons mis au point l'incorporation de cette intégrine dans une bicouche lipidique supportée. Pour imiter la formation d'adhérences focales, nous avons immobilisé ces membranes dans des îlots micro-imprimés recouverts de matrice extracellulaire. Dans cet essai biochimique, l'effet de la force de l'actomyosine sur la diffusion de protéines fluorescentes telles que l'intégrine et ses activateurs taline-1 et kindline-2 est évalué par FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) à I2BC. En parallèle, nous développons une stratégie pour suivre les mouvements de protéines uniques afin de déchiffrer les changements dans l'organisation nanométrique de l'intégrine et de ses régulateurs en réponse à la force. Une première série d'expériences a été réalisée à l'IINS pour suivre le mouvement de la kindline-2 fluorescente photo-activable dans ce test. Les stratégies ci-dessus devraient apporter de nouvelles informations sur la régulation de l'intégrine. Au CINAM, l'observation de la liaison des vésicules unilamellaires géantes (GUV) contenant de l'intégrine à des surfaces recouvertes de matrice extracellulaire a été évaluée par RICM. Dans cette configuration expérimentale, les GUV s’étalent et s'ouvrent, offrant un accès à des régulateurs tels que la taline. Il est donc possible d'étudier l'effet de la liaison de l'intégrine à l'ECM sur le recrutement des régulateurs cytoplasmiques de l'intégrine.

Nous allons continuer à décrire la régulation des intégrines par la taline et la kindline et débuter l'étude de la tensine qui est supposée réguler l'intégrine. Nous testerons également l'effet de l'élasticité de la matrice extracellulaire en mimant ces polymères naturelles par des gels synthétiques aux propriétés mécaniques bien contrôlées. Enfin, pour faciliter les expériences, nous mettrons au point une version miniature recombinante de l'intégrine.

Talin dissociates from RIAM and associates to vinculin sequentially in response to the actomyosin force.
Vigouroux C, Henriot V, Le Clainche C.
Nat Commun. 2020 Jun 19;11(1):3116. doi: 10.1038/s41467-020-16922-1.

Actin polymerization downstream of integrins:
signaling pathways and mechanotransduction
Romero S, Le Clainche C, Gautreau AM.
Biochem J. 2020 Jan 17;477(1):1-21. doi: 10.1042/BCJ20170719.

Les cellules s’adaptent aux propriétés de leur environnement. Les adhésions focales (FAs) sont des structures mécanosensibles qui adaptent l’adhésion de leurs récepteurs intégrines à la force de l’actomyosine et aux propriétés physiques de la matrice extracellulaire (ECM). Notre projet a pour but d’identifier les liens entre la force de l’actomyosine, la régulation des intégrines et les propriétés de l’ECM qui expliquent la mécanosensibilité des FAs. Pour cela, nous reconstituerons un complexe d’adhésion fait d’une membrane supportée contenant des intégrines qui relient des câbles d’actomyosine, via des protéines régulatrices, d’un côté, et une ECM microstructurée de l’autre côté. Le suivi en microscopie des trajectoires des molécules uniques des composants du système, où la concentration des composants, la force de l’actomyosine et les propriétés physiques de l’ECM sont modulables, identifiera les réactions mécanosensibles. L’importance des découvertes sera testée dans des cellules.