Contrôle de l'actine endosomale et de la ciliogenèse par la GTPase Rab35 et deux nouveaux effecteurs: une approche intégrée. – RabEndoCilio

Un atout de ce projet est la forte synergie entre les trois équipes, permettant une analyse multi-échelle avec des approches :

- de Biologie Cellulaire (Partenaire 1, Institut Pasteur). Il s'agira d'identifier le ou les effecteurs de Rab35 impliqués dans la genèse des cils primaires en utilisant des modèles cellulaires et de comprendre les mécanismes moléculaires/cellulaires sous-jacents. La microscopie par fluorescence en cellules vivantes sera une méthode centrale utilisée.

- de Biologie Structurale (Partenaire 2, Institut Curie). La détermination de la structure atomique par diffraction aux rayons X permettra de comprendre l'interaction Rab35/effecteurs et de déterminer des mutations capables d'abolir les interactions.

- et de Biologie du Développement (Partenaire 3, Ecole Polytechnique). L'effet de l'inactivation de l'expression de Rab35 et d'effecteurs sélectionnés sera étudié lors du développement de l'embryon de poisson-zèbre.

Grâce à ce projet, nous avons identifié un effecteur central de la GTPase Rab35 impliqué dans la formation des cils motiles et primaire in vivo. Nous avons appelé cet effecteur miniBAR (également appelé GARRE1) du fait de sa caractéristique structurale (domaine BAR tronqué).

Nous avons

- montré que MiniBAR interagit directement avec deux GTPases (Rac1 et Rab35) via des domaines distincts

- résolu la structure 3D des domaines de MiniBAR interagissant avec Rab35 et avec Rac1

- montré que miniBAR co-localise avec Rab35 et Rac1 sur des endosomes dynamiques

- montré que la déplétion de miniBAR ainsi que l'interaction avec les deux GTPases est clé pour réguler la longueur des cils primaires dans des cellules RPE-1 en culture

- étudié le rôle de miniBAR dans la poisson-zèbre et mis en évidence que la déplétion de MiniBAR conduit à des défauts typiques de ciliopathie

- montré que miniBAR régule à la fois le trafic de protéines clés dans la biogenèse des cils et dans la régulation de la contractilité dépendant de l'actine et de la myosine II cellulaire, expliquant sont rôle de coordonateur dans la ciliogenèse.

Les résultats principaux obtenus lors du projet ont été publiés en 2023 dans le journal international Developmental Cell.

Ce travail ouvre de nouvelles perspectives sur la ciliogenèse et suggère que des mutations dans le gène miniBAR pourraient être responsables de ciliopathies chez l'Homme.

Talks:
22 May 2019 — Cytoskeleton club, Institut Jacques Monod, Paris
3-5 October 2019 — BCI Retreat, Spain

Posters:
2018 — BCI Day
27-29 November 2019 — International Conference on Cilia, Flagella and Centrosomes, Institut Imagine, Paris

Les GTPases de la famille Rab sont des régulateurs clés du trafic membranaire dans toutes les cellules eucaryotes. Vu l'importance du trafic intracellulaire dans la physiologie cellulaire, les GTPases Rab, leurs effecteurs et leurs régulateurs ont été impliqués dans de nombreuses maladies humaines, notamment des maladies immunes, des maladies neurodégénératives ou des cancers. Ces dernières années, la GTPase Rab35, localisée à la membrane plasmique et sur les endosomes a attiré une attention croissante car elle contrôle le trafic d'une multitude de cargos clés. Récemment, des mutations dans la protéine Rab35 de patients atteints de cancers ont été impliquées dans le processus tumoral, car elles provoquent un trafic anormal du récepteur au PDGF et à l’EGF. L'intérêt pour Rab35 a rapidement dépassé la communauté du trafic intracellulaire, car Rab35 est désormais impliquée dans des fonctions reliées à l'immunologie, à la microbiologie et à la neurobiologie. Cependant, on ne comprend pas comment Rab35 contrôle tant de fonctions clés. De plus, il reste à établir si Rab35 est impliquée dans ces nombreuses fonctions in vivo, à l'échelle de l'organisme.

Plusieurs de ces fonctions sont liées à un rôle central de Rab35 et de ses effecteurs dans la régulation du trafic endosomal, en particulier en contrôlant la polymérisation/dépolymérisation de l’actine sur les endosomes. Cependant, aucun des effecteurs connus de Rab35 impliqués dans le trafic membranaire ne permet d’expliquer directement comment cette GTPase régule la dynamique de l’actine à la surface des endosomes. Il s’agit d’une question importante, car le rôle de l’actine dans le trafic endosomal est encore mal compris bien que crucial.

Le but du projet sur 4 ans RabEndoCilio est de révéler comment Rab35 et deux effecteurs identifiés régulent le cytosquelette d’actine, le trafic endosomal et les fonctions des cils motiles et primaires, par une approche allant de la structure à la fonction dans les cellules jusqu’aux études in vivo dans le poisson-zèbre.

Un atout de ce projet est la forte synergie entre les 3 équipes, permettant une analyse multi-échelle avec des approches de Biologie Cellulaire (Partenaire 1, Institut Pasteur), de Biologie Structurale (Partenaire 2, Institut Curie) et de Biologie du Développement (Partenaire 3, Ecole Polytechnique).

La faisabilité du projet est attestée par des résultats préliminaires solides. L’équipe 1 a identifié deux nouveaux partenaires de Rab35 qui sont d’excellents candidats pour réguler la dynamique de l’actine. Les équipes 1 et 2 ont obtenu des informations structurales préliminaires sur ces partenaires. Les équipes 1 et 3 ont des résultats indiquant que Rab35 et au moins l’un de ses partenaires contrôlent la formation des cils in vitro et in vivo.

Nous répondrons aux questions suivantes :

1- Quels sont les effecteurs de Rab35 qui contrôlent spécifiquement et directement la dynamique de l'actine sur les endosomes ?
2- Comment, au niveau mécanistique, ces effecteurs régulent-ils le cytosquelette d'actine sur les endosomes ?
3- Quelles sont les fonctions qui requièrent le remodelage de l’actine par Rab35 in vivo ?
4- Est-ce que les nouveaux effecteurs de Rab35 régulant l'actine endosomale contrôlent ces fonctions in vivo ?

Grâce à ces approches différentes et complémentaires impliquant les échelles structurales, cellulaires ou in vivo, ce projet devrait permettre de mieux comprendre le rôle de l’actine sur les compartiments endosomaux. De plus, il apportera, pour la première fois, une vision intégrée du rôle de Rab35 et de l'actine endosomale dans la physiologie cellulaire, depuis le niveau moléculaire jusqu'au niveau de l'organisme.

Le réseau moléculaire ainsi identifié devrait également éclairer le rôle essentiel de Rab35 dans des fonctions apparemment non reliées, comme la phagocytose, la production des exosomes, la formation des synapses immunologiques, la migration cellulaire ou le développement des neurones.