CE13 - Biologie Cellulaire, Biologie du Développement et Evolution

Contrôle post-transcriptionel par les uORF de l’activité d’une niche de cellules souches végétale – ReinitiaTOR

Contrôle de la réinitiation de la traduction de l'ARNm par les cadres de lecture ouverts (uORF)

La cible de la rapamycine (TOR) fonctionne comme une plaque tournante qui relie un large éventail de stimuli externes à la production de protéines. Chez les plantes, la production de protéines est limitée par des cadres de lecture ouverts en amont (uORF) situés dans les 5'UTR d'environ 30 % des ARNm eucaryotes. Le mécanisme de suppression de la traduction par les uORF et les facteurs de réinitiation qui médient le potentiel inhibiteur des uORF ne sont pas encore clairs in planta.

Mécanisme de réinitiation de la traduction et son contrôle par la cible de la rapamycine (TOR)

Chez les plantes, la synthèse des protéines est supprimée par des cadres de lecture ouverts en amont (uORF) situés dans l'UTR 5'des ARNm (ARNm uORF). La traduction de l'ARNm uORF nécessite un mécanisme de réinitiation qui permet de multiples événements d'initiation sur le même ARNm sous le contrôle de TOR. Nous étudions le mécanisme et les facteurs qui aident à surmonter les obstacles à la réinitialisation de la traduction de l'ARNm et qui régulent la physiologie et la croissance des plantes. En plus des facteurs de réinitiation connus, nous avons découvert un autre facteur essentiel. Nous avons découvert que la spermidine (Spd), un puits d'azote et une molécule de signalisation, active TOR et aide ainsi à traduire les ARNm uORF codant pour des enzymes impliquées dans le catabolisme de la Spd, tandis que l'inhibition de la biosynthèse de la Spd entraîne l'inactivation de TOR et des défauts de croissance. Nous avons découvert que, chez Arabidopsis, le mécanisme de réinitiation de la traduction opère sous le contrôle de TOR dans le méristème apical caulinaire (SAM), fortement enrichi en ARNm uORFs, un tissu spécialisé contenant le centre quiescent et responsable de la croissance et du développement de la plante

Le développement récent des techniques de séquençage de l'ARNm permettant d'obtenir des empreintes de ribosomes (RF a modifié les études sur la synthèse des protéines notamment chez les plnates. En utilisant cette méthode, nous avons réalisé une cartographie précise des positions des ribosomes sur les ARNm afin de suivre leur dynamique dans différentes conditions contrastées de TOR. Les polyribosomes ont été obtenus par immunopurification à partir de plantules transgéniques d'Arabidopsis exprimant, grâce à des promoteurs spécifiques du méristème apical caulinaire, la protéine ribosomale étiquetée L18 intégrée dans des ribosomes fonctionnels. Le profilage RF a révélé un effet inhibiteur de l'uORF sur la traduction des ARNm dans des conditions d'inactivation de TOR. L'effet de TOR sur la traduction a été confirmé par plusieurs techniques - analyse des niveaux d'ARNm endogènes dans les polyribosomes, niveaux de traduction d'ARNm dans des protoplastes de mésophylle, analyse d'images de microscopie confocale des niveaux de protéines et de l'activité de SAM. Dans l'ensemble, nous présentons une approche expérimentale qui met en évidence la régulation de la synthèse des protéines dans des conditions limitantes en énergie.

Nous avons utilisé la bibliothèque d'ARNm uORF pour sélectionner les uORFs ayant un effet inhibiteur sur la traduction des ARNm qui est atténué par l'activation de TOR. L'analyse du mécanisme de réinitiation nous a permis d'identifier la protéine RACK1 comme un acteur clé de la réinitiation de la traduction. Nous avons découvert un nouvel effecteur de TOR en amont, la spermidine, qui active TOR et améliore la traduction des ARNm uORF. De plus, TOR régule négativement le métabolisme de la spermidine pendant le développement des plantules de maïs et d'Arabidopsis. TOR supprime les réponses au stress par la régulation globale de la triméthylation H3K27 déposée sur la chromatine par CURLY LEAF (CLF), codée par un ARNm uORF.

Pour la première fois, nous avons montré que TOR, en détectant la suffisance en spermidine, peut réguler l'homéostasie de la spermidine en facilitant la réinitiation de la traduction des ARNm contenant des uORF codant pour des enzymes qui dégradent les polyamines. À l'avenir, la combinaison de notre approche avec l'analyse directe des niveaux endogènes de spermidine et d'autres polyamines nous permettra de mieux comprendre comment l'homéostasie des polyamines est régulée par TOR.

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Chez les plantes et les humains, la croissance et la régénération des tissus eukaryotes dépendent d’une balance fine entre division et entrée en différentiation des cellules souches. Des efforts majeurs ont été faits pour analyser les mécanismes transcriptionnels et épigénétiques contrôlant les cellules souche mais le rôle des régulations post-transcriptionnel dans les niches de cellules souches demeure largement inconnu. La traduction est une étape clé dans le contrôle de l’activité d’un gène et les uORF (upstream ORF ou ORF amont) présent à l’extrémité 5’ non transcrite de l’ARN sont considéré comme des répresseurs majeurs de la traduction. Chez les plantes, les uORF sont sous le contrôle de Target of Rapamycin (TOR), régulateur central de la croissance. Nous avons mis en évidence un enrichissement important en uORF dans les ARN codant des régulateurs des cellules souches végétales et nous étudierons ici le répression de la traduction par les uORF et le rôle de TOR dans la régulation de ce processus dans le méristème apical caulinaire, un tissue spécialisé contenant une niche de cellules souches et responsable de la construction de la partie aérienne des plantes. TOR est aussi sous le contrôle de l’hormone végétale auxine suggérant une fonction TOR-dépendante dans le contrôle du niveau de protéines régulatrices de l’activité des cellules souches qui sera testée dans ce projet. Les connaissances disponibles dessinent donc un scénario où l’activité de TOR en aval de l’auxine pourrait permettre de modifier rapidement l’activité de la niche de cellules souches au cours du développement, une hypothèse centrale que nous testerons dans ce projet.
Le projet aura quatre objectifs :
1- L’identification des ANRm méristématiques dont la traduction est réprimée par des uORF et la caractérisation du rôle de TOR dans l’activation de leur traduction.
2- La caractérisation des mécanismes moléculaires par lesquels eIF3h agit sur la réinitiation de la traduction en réponse à TOR
3- L’analyse de l’impact de la modulation de la répression par les uORF obtenue en faisant varier l’activité de TOR sur l’organisation du méristème apical caulinaire et l’organogenèse
4- L’analyse de la fonction TOR-dépendante de l’auxine dans la régulation de l’activité de la niche de cellule souche dans le méristème apical caulinaire.
Ces approches devraient permettre d’identifier les gènes du méristème sous contrôle post-transcriptionnel par l’auxine et TOR. Ce projet génèrera des connaissances fondamentales sur des mécanismes de réinitiation de la traduction encore peu compris et devrait permettre de mieux comprendre ces mécanismes chez les animaux. En effet étant donné la forte conservation de TOR au cours de l’évolution, comprendre comment TOR impacte le fonctionnement d’une niche de cellules souches devrait fournir de nouveaux outils pour manipuler l’activité des cellules souches chez les plantes et également dans les cellules animales. Chez l’homme, les retombées de ce projet pourrait aussi permettre d’identifier des stratégies pour combattre la tumorigenèse et chez les plantes, des données récentes montre que la régulation de l’homéostasie de la niche de cellules souches du méristème apical caulinaire est une cible de choix pour la manipulation du rendement.

Coordination du projet

Lyubov Ryabova (CNRS-Institut de biologie moléculaire des plantes (IBMP))

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS-IBMP CNRS-Institut de biologie moléculaire des plantes (IBMP)
RDP- CNRS REPRODUCTION ET DEVELOPPEMENT DES PLANTES

Aide de l'ANR 522 786 euros
Début et durée du projet scientifique : octobre 2018 - 48 Mois

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