Evolution et dynamique de dissémination de la tolérance aux antibiotiques dans les biofilms – EvoTolAB

Le projet EvolTolAB s'appuie sur 3 approches principales:
1- le développement de 3 modèles expérimentaux de formation de biofilms avec une pertinence croissante au regard des biofilms qui se forment sur matériel médical en clinique: un modèle in vitro sur disque de silicone, un modèle in vitro avec des chambres implantables pédiatriques et un modèle in vivo chez le rat implanté avec une chambre pédiatrique.
2- l'utilisation d'évolution expérimentale où nous mimons un traitement intermittent d'une infection à biofilm (Escherichia coli) par des doses létales d'antibiotique, et qui nous permet de conserver les fossiles de l'évolution du biofilm sous pression de sélection antibiotique et ainsi de pouvoir retracer la trajectoire évolutive des bactéries dans ces conditions.
3- l'utilisation d'une technique de bar-coding qui nous permettra d'étudier la dissémination et la dynamique de croissance des bactéries, notamment résistantes, lorsqu'un biofilm est sous pression de sélection antibiotique.

- Nous avons terminé les expériences d'évolution expérimentale sur des biofilms et des cultures planctoniques en utilisant la souche clinique LF82 d'E. coli et un traitement intermittent de deux concentrations létales d'un aminoglycoside, l'Amikacine. Les profils de survie ainsi que la CMI de la population et la fréquence de la résistance ont évolué très différemment dans les biofilms et les cultures planctoniques. L'augmentation rapide de la survie, de la CMI et de la fréquence des mutants observés dans les biofilms n'a pas été observée dans les cultures planctoniques, ce qui démontre que les biofilms peuvent à la fois protéger les bactéries des agressions antibiotiques et permettre une repousse progressive par l'apparition probable de mutants résistants.
- Nous avons analysé la présence de modifications génomiques dans les populations et clones évolués par rapport à la population ancestrale. La principale différence entre l'évolution planctonique et celle des biofilms réside dans l'apparition exclusivement en biofilms de mutations dans le gène fusA, codant pour un facteur d'élongation des ribosomes, qui ont un coût de fitness élevé mais permettent une augmentation importante de la CMI.
- Nous avons mis au point les modèles in vitro et in vivo de colonisation de biofilms en chambre pédiatrique.
- Nous avons mis au point la technologie des codes-barres dans une souche modèle d'E. coli.

- Nous sommes actuellement en train de reconstruire des souches portant uniquement les mutations fusA pour essayer de comprendre comment ces mutations à coût d'adaptation élevé peuvent émerger et être maintenues dans des biofilms alors qu'elles sont probablement contre-sélectionnées dans la population planctonique.
- Nous commençons à réaliser des expériences d'évolution in vitro et in vivo avec des chambres pédiatriques
- La première bibliothèque de codes-barres de LF82 devrait être construite dans les prochains mois pour permettre notre première expérience d'évolution adaptative sur des biofilms. Dans un premier temps, nous essaierons de comprendre comment la croissance des biofilms module la diversité de la bibliothèque de clones à codes-barres avant de pouvoir passer à de véritables expériences d'évolution adaptative.

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Les infections bactériennes et la résistance croissante aux antibiotiques constituent un problème majeur de santé publique. Souvent chroniques ces infections sont dues à la présence de communautés appelées biofilms se développant sur des dispositifs médicaux ou des muqueuses. Dans les biofilms, les bactéries subissent des changements physiologiques spécifiques et présentent un haut niveau de tolérance à la fois aux agents antimicrobiens et aux défenses immunitaires de l'hôte. En conséquence, il n'existe actuellement aucune méthode totalement efficace pour prévenir ou éradiquer les biofilms.
La récurrence des infections chroniques s'explique par la présence dans les biofilms de niveaux élevés de bactéries dites persistantes qui supportent une concentration extrêmement élevée d'antibiotiques et repoussent sous forme de biofilms après la fin du traitement. Les bactéries persistantes pourraient servir de réservoir évolutif à l’émergence de résistance. La présence de ces bactéries persistantes peut s'expliquer principalement par une quiescence et une réponse au stress causées par une forte hétérogénéité physico-chimique et des niches dans laquelle les bactéries du biofilms sont en carence. Jusqu’alors l'impact des bactéries persistantes en clinique a été largement négligé et l'évolution de la tolérance reste peu comprise. Cependant, des études récentes ont démontré que des niveaux élevés de tolérance aux antibiotiques, mais pas de résistance, pouvaient être rapidement atteints par l'exposition de cultures planctoniques d'E. coli et d'autres pathogènes à des traitements cycliques de concentration létale d'antibiotiques. Compte tenu de l'importance des biofilms dans les infections chroniques et de l'échec de leur traitement, il est urgent de caractériser l'évolution de la persistance et de la résistance au sein des biofilms.
Nous avons développé un modèle in vitro de biofilms d'E. coli pathogènes sur des disques de silicone. Nous avons montré, par des d'expériences d'évolution adaptative en laboratoire (ALE) mimant le traitement intermittent d’infections chroniques, que les biofilms de E. coli pouvaient rapidement évoluer vers une résistance accrue aux aminosides via l'accumulation de mutations connues pour provoquer une résistance. Ces expériences préliminaires suggèrent fortement que la voie évolutive suivie par les biofilms et les bactéries planctoniques est différente, les biofilms favorisant fortement l'émergence rapide d’une résistance génétique, peut être en raison de leur mutabilité accrue et de la fréquence élevée des bactéries persistantes présentes dans les biofilms. Ces premiers résultats prometteurs encouragent une analyse approfondie de l'émergence de la résistance aux antibiotiques dans les biofilms.
En utilisant des E. coli pathogènes, des expériences d’ALE, le modèle de biofilm in vitro développé et un modèle in vivo cliniquement pertinent d'infection liée au cathéter, nous poursuivrons l'analyse des trajectoires évolutives qui peuvent conduire, dans des environnements de biofilms cliniquement pertinents, à des niveaux de tolérance accrus, puis à une résistance à des concentrations létales d’antibiotiques différents de classes différentes. Nous déterminerons si l'émergence de résistance dans les biofilms est directement liée à la fréquence des bactéries persistantes. De plus nous analyserons, en utilisant un marquage par code-barres ADN, la dynamique de dissémination des clones tolérants/résistants au sein des biofilms et le repeuplement de ceux-ci à l'arrêt du traitement.
Ce projet devrait contribuer à améliorer notre compréhension des relations dynamiques au sein des biofilms entre la tolérance et l'émergence de la résistance aux antibiotiques, ainsi que de la dissémination de cette tolérance/résistance dans des environnements hautement structurés. Cela pourrait mener à des stratégies permettant de contrôler le développement de tolérance et résistance aux antibiotiques dans des situations cliniquement pertinentes.