Dynamique structurale des complexes NMD: détecteur et effecteur – DEFineNMD

Les stratégies que nous utilisons sont basés sur trois principes: l'étude des complexes purifiés, la reconstitution et l'étude fonctionnel et structurel des complexes in vitro et l’étude du rôle et de la dynamique des divers composants et sous-complexes dans le NMD.

Les résultats préliminaires ont mis en évidence des nouvelles caractéristiques de l'hélicase Upf1, un facteur essentiel pour le NMD, ainsi que des nouvelles structures d'un facteur NMD seul et en complexe avec Upf1.

Les résultats préliminaires seront validés et permettront la rédaction d'articles scientifiques.

En cours.

Le processus de NMD ("nonsense mediated mRNA decay"), est une voie majeure de contrôle qui déstabilise les ARNm contenant des codons stop prématurés et codant des protéines tronquées non désirées. La diversité des cibles du NMD n'est apparue que récemment et s’avère être beaucoup plus étendue qu’estimé auparavant. Le NMD façonne littéralement le transcriptome des cellules eucaryotes, car la transcription "pervasive", la synthèse d’ARN non-codants, l'inefficacité de l’épissage des ARN, ainsi que l’imprécision des sites de démarrage de la transcription, sont autant d’événements qui génèrent des substrats du NMD. Malgré l'importance de cette voie et la conservation des facteurs majeurs du NMD, Upf1, Upf2 et Upf3, de la levure à l’homme, les modèles actuels du NMD sont parcellaires et dépendent de facteurs qui ne sont pas universellement présents chez les eucaryotes. En outre, de nombreux liens moléculaires manquent pour relier la reconnaissance d'un codon stop aberrant à la dégradation de l'ARNm correspondant.
En utilisant une stratégie de purification rapide de complexes protéiques couplée à la spectrométrie de masse quantitative, nous avons découvert l'existence de deux complexes distincts opérant pour le NMD chez la levure. Ces deux complexes partagent un seul facteur en commun, l'ARN hélicase Upf1, dont les activités enzymatiques sont absolument essentielles pour le NMD. Nous avons appelé "Détecteur" le complexe composé des trois protéines majeures Upf1, Upf2, Upf3, et "Effecteur" le complexe contenant Upf1 et plusieurs facteurs de dégradation de l'ARN. L'existence de ces deux complexes successifs permet de proposer un nouveau modèle pour le NMD qui tient compte uniquement de facteurs universellement conservés. De plus, ces données remettent en question les modèles précédents, et permettent d’émettre de nouvelles hypothèses concernant le mécanisme de NMD et notamment la transition détection-dégradation.
Le projet DEFineNMD est construit sur le modèle Détecteur/Effecteur et sur de récentes avancées conceptuelles dans le domaine. Basé sur des expertises complémentaires, les quatre partenaires combineront des approches de biochimie, de cristallographie, de biophysique et de génomique fonctionnelle pour étudier la structure et la fonction de ces complexes. Nous caractériserons le mode d’interaction et la structure des sous-complexes formés autour d'Upf1 par des approches in vivo et in vitro à l’aide de complexes reconstitués. Le rôle de l’activité hélicase d’Upf1 dans l’assemblage et le remodelage des complexes détecteurs et effecteurs sera étudié à l’échelle de la molécule unique par des méthodes biophysiques utilisant des pinces magnétiques. Nous utiliserons également des stratégies quantitatives basées sur la spectrométrie de masse et sur la modification chimique des protéines pour étudier la dynamique des complexes NMD in vivo. Nos données biophysiques et structurales seront étayées par des études fonctionnelles chez la levure. Finalement, les prédictions du modèle Detecteur/Effecteur seront testées dans des cellules de mammifères, pour identifier les similarités et différences entre des espèces très divergentes.
Ce projet permettra de clarifier les mécanismes moléculaires du NMD, qui, par la suite, permettront de prédire la reconnaissance et la stabilité des cibles ARN de cette voie. Ces résultats permettront de mieux comprendre les contraintes imposées par le NMD sur l’évolution des séquences génomiques en corrélation avec l'expression des gènes. Une vision claire des mécanismes moléculaires sera essentielle pour appréhender l'implication du NMD dans de nombreuses voies cellulaires, comme la maintenance des télomères, les interactions virus-cellule hôte, et la carcinogenèse.