Sondes Fluorogéniques Programmables pour de l’Imagerie Super-Résolutive – PFPImaging

Afin d'améliorer la résolution temporelle, il est donc essentiel de réduire le bruit de fond. Dans ce contexte, les colorants organiques ont suscité notre attention en tant que rapporteur fluorescent. Parmi les fluorophores organiques, nous avons particulièrement porté notre attention sur ceux qui «activent« leur intensité de fluorescence, également connus sous le nom de colorants fluorogéniques, en réponse aux interactions avec leurs cibles biomoléculaires. Ces colorants doivent produire un signal d'émission spécifique à la cible et assurer une imagerie sans bruit de fond. Pour maximiser la résolution spatio-temporelle, ces colorants émissifs doivent également présenter une brillance, une photostabilité et une sélectivité élevées. Les sondes organiques répondant à toutes ces conditions sont rares. Pour relever ce défi, nous avons exploré 2 approches. La première approche repose sur l’introduction de sondes fluorogéniques sensibles aux changement environnementaux. Ainsi, le brin imageur, en se liant au brin d’ancrage complémentaire devra conduire à un environnement où le fluorophore où il sera moins mobile et moins hydraté. Parmi les fluorophores qui sont sensibles à l’hydratation et/ou à la viscosité du milieu différentes familles de lfuorophores ont retenu notre attention. La seconde approche s’appuie sur un nouveau concept que nous avons introduit, le DRET intermoléculaire (DRET : Dark Resonance Energy Transfer). Elle consiste à synthétiser des sondes très éteintes puis de les hybrider sur un brin d'ancrage marqué par un accepteur brillant afin que le donneur éteint transfère son énergie par résonance à l’accepteur et ainsi permette sa détection.

Grâce à la chimie click, nous avons mis au point un protocole de synthèse robuste permettant d'effectuer de manière efficace la liaison covalente de différents fluorophores sur le brin imageur. La nature du lien de couplage et sa position spécifique surle brin ont également joué un rôle crucial dans notre processus de sélection. Une caractérisation approfondie des propriétés d'absorption et d'émission a mis en évidence deux candidats particulièrement intéressants pour l’approche fluorogénique et le DRET. Nos études nous ont également permis d’identifier les séquences produisant les augmentations de signal les plus significatives. La plus importante amplification du signal a été constatée en utilisant le DRET. Ce système a été exploité de manière privilégiée pour les études de microscopie en molécule unique et super-résolutive. Il a permis de mettre au point une nouvelle modalité d’imagerie, qui a été implantée sur la plateforme d’imagerie PIQ-QUEST, labellisée IBISA et faisant partie du nœud Alsace de France BioImaging. Elle est ainsi ouverte à une large communauté d’utilisateurs. Sur la période, la majorité des objectifs initiaux ont été atteints. Seule l’étude d’une sonde fluorogénique sensible aux changements environnementaux en molécule unique et en imagerie n'a pas été réalisée. Cependant, ce projet nous a permis d'établir un protocole de synthèse versatile et souple, nous permettant désormais de cribler plus rapidement les rapporteurs fluorescents. Cette partie du projet pourra donc être poursuivie plus efficacement. Le résultat le plus marquant de nos travaux a été obtenu par l’introduction de la modalité d’imagerie super-résolue en DRET. En comparaison aux 30 minutes nécessaires pour le système conventionnel, il permet d'acquérir des images super-résolues des microtubules cellulaires en un temps de 30 secondes. Récemment, d'autres équipes ont publié des solutions alternatives au DRET. Notre système se compare favorablement aux deux modalités. Cependant, un inconvénient de notre système par rapport à ces derniers est qu'il ne permet pas la collecte d'images sur une période aussi longue en raison du photoblanchiment de l'accepteur. Des pistes d'amélioration sont envisageables pour contourner cet inconvénient et rendre plus performant le DRET.

En conclusion, ce projet soutenu par l'ANR nous a permis de concevoir des sondes fluorescentes originales pour la microscopie photonique et d’introduire une nouvelle modalité de microscopie. Il ouvre la voie à des applications plus rapides et plus efficaces dans le domaine de l'imagerie cellulaire à haute résolution. Ces résultats prometteurs élargissent les possibilités de la recherche en biologie cellulaire et ouvrent la porte à de nouvelles avancées dans l'étude des structures moléculaires. Ce travail a également ouvert la voie à de nouvelles collaborations avec d’autres équipes en vue d'exploiter le DRET pour de nouvelles applications.

L’ensemble de ce travail a donné lieu à 3 articles publiés et 3 articles soumis à publication ou en préparation. Les articles publiés concernent le développement et la caractérisation des nouvelles sondes de fluorescence. Un article soumis décrit les résultats obtenus en imagerie super-résolutive. Ces travaux ont fait l'objet de 7 présentations orales dans des congrès ou journées thématiques dont 3 à l’international ainsi qu' à 4 présentations par affiche. Ils ont également servi de support à deux thèses, une en chimie et une en biophysique.

PFPImaging décrit les étapes et collaborations nécessaires à la synthèse de sondes fluorescentes fluorogéniques programmables pour une imagerie super-résolutive plus performante. L'état de l'art décrit l'existant et les manques technologiques. PFPImaging répond à ces manques en suivant un cahier des charges précis. Les nouveaux outils mieux adaptés seront adaptables à la détection et visualisation des acides nucléiques et protéines. Les collaborations décrivent les expertises de chacun des partenaires, l'un en chimie des acides nucléiques fluorescents et l'autre en détection photo-physique et imagerie moléculaire in vitro et in cellulo. Les perspectives poursuivies sont d’améliorer considérablement in cellulo la visualisation de la tubuline dans un premier temps pour confirmer les performances de ces nouveaux outils. A moyen terme la méthode est généralisable à l’observation d’autres cibles protéiques ou d’acides nucléiques du cytoplasme, génome et autres organelles cellulaires.