Démêler les voies de signalisation impliquées dans l'enkystement des amibes pathogènes – AmoCyst

Le processus de formation des kystes est appelé « enkystement ». Bien que répandu chez les êtres microscopiques, l’enkystement est très mal connu compte-tenu de la multitude des processi utilisés et du peu de donnés génétiques (ou d’outils moléculaires) chez les organismes concernés. Notre projet dresse un atlas des modifications observées aux niveaux des transcrits, des protéines et des phospho-protéines durant les premières heures de l'enkystement de l'amibe A. castellanii. Nos résultats confirment une observation déjà rapportée par Griffiths et Maureen Bowen il y a 50 ans de cela, à savoir, l’enkystement induit une forte activité de déphosphorylation au sein de l’amibe. Nous avons complété notre phospho-protéome par une analyse du transcriptome (ensemble de transcrits) et du protéome (somme des protéines) qui a montré que la déphosphorylation est suivie d’une forte expression des gènes liés à la dégradation protéique ou dans la synthèse des carbohydrates comme la cellulose qui sont indispensables à la formation de la paroi du kyste. Par ailleurs, nous avons observé une diminution de l’expression des gènes impliqués dans l’activité métabolique des amibes.

La production liée à ce projet est de 2 articles de recherche (Bernard C. et al., 2022, Nature Communications 13(1): 4104 et Rolland S. et al., 2020, Pathogens 9 (5), 321) et d’un article de recherche en Pre-print (Rolland S. et al., 2021, BioRxiv doi.org/10.1101/2021.01.07.425711).

La publication de Bernard C. et al., 2022 répond parfaitement à la question initialement posée. Nous fournissons à la fois des données transcriptomiques, protéomiques et phosphoprotéomiques de l'enkystement d'A. castellanii qui permettent d'obtenir une image complète des processus biologiques affectés durant l'enkystement. L'analyse globale des trois différentes approches omiques montre que, contrairement aux protéines, les niveaux des transcrits et des phospho-motifs ont été modifiés dès une heure après le début de l'enkystement. Les modifications du niveau des protéines sont plus graduelles, et principalement observables après huit heures. Ainsi, il semble que l'amibe A. castellanii répond rapidement à la carence nutritive par des événements de phosphorylation de protéines et au niveau de la transcription. Une réponse aussi rapide est probablement due à un nombre élevé de récepteurs avec 35 récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs). Nous avons déposé sur le serveur bioRxiv (Rolland S. et al., 2021, BioRxiv) un article de recherche dans lequel nous montrons que la sur-expression d’un gène codant une protéine G couplée à un récepteur (G-protein coupled receptor (GPCR)) affecte l’enkystement de A. castellanii. De même, la surexpression d’une acetyl-transferase putative et d’origine bactérienne ralentie la formation de kystes (Rolland S. et al., 2020, Pathogens). Ces 3 publications scientifiques permettent de mieux comprendre l’initiation de l’enkystement chez A. castellanii.

Le projet AMOCYST ambitionnait de mettre en lumière les voies de signalisation différentiellement régulées durant l’enkystement de l’amibe Acanthamoeba castellanii. Nous avons atteint notre objectif avec la publication de l’article « Bernard C. et al., 2022 Nature Communications ». Cette masse de données devrait vraisemblablement aider à comprendre la chorégraphie moléculaire mise en jeu par d’autres organismes capables de s’enkyster tels que les pathogènes responsables de l’amibiase (Entamoeba histolytica) ou de la toxoplasmose (Toxoplasma gondii). Ces résultats pourront être utilisés pour rechercher de nouvelles cibles anti-amibiennes efficaces contre les kystes. Par exemple, nous avons découvert que la protéine ACA1_112600 est fortement exprimée au niveau ARN et protéine dès les premières heures de formation du kyste. Cette protéine de 72 acides aminés représente une cible intéressante pour inhiber la formation de kystes car elle ne présente aucune homologie de séquence, ni de domaine fonctionnel, avec les protéines connues. Avant d’approcher les organismes valorisateurs et leurs mandataires (CNRS Innovation, Agence Aliénor Transfert, …) pour une maturation technologique qui in fine s’adressera aux agences qui analysent la qualité des eaux et aux industriels dont les activités procurent un environnement favorable au développement d’amibes, il faudrait rechercher d’éventuelles homologies structurales, identifier les protéines susceptibles d’interagir avec cette protéine et valider l’importance de cette protéine durant l’enkystement. Des perspectives qui nécessitent encore de trouver des financements.
Dans le projet AMOCYST, nous avions également proposé d’identifier le mécanisme par lequel la bactérie Parachlamydia acanthamoebae inhibe l’enkystement des amibes. Si nous avons réussi à collecter les données de transcriptomiques, de protéomiques et de phosphoprotéomiques, nous n’avons malheureusement pas eu le temps d’analyser ces données. La crise COVID-19 a exacerbé le retard que nous avions eu au niveau de l’analyse protéomique. L’exploitation des données demande également de trouver de nouveaux financements.

La production est de :
- 2 articles de recherche scientifiques (Bernard C. et al., 2022, Nature Communications 13(1): 4104 ; Rolland S. et al., 2020, Pathogens 9 (5), 321) ;
- 2 articles de revue (Samba-Louaka A., 2021, Toxins 13(8):526; Samba-Louaka A. et al., 2019, FEMS Microbiology Reviews 1; 43(4): 415-434)
- et d’un article de recherche en Pre-print (Rolland S. et al., 2021, BioRxiv).

Les amibes libres sont des protozoaires opportunistes que l'on retrouve dans les milieux aqueux naturels et artificiels. Elles se nourrissent de bactéries qu'elles phagocytent. Toutefois, de nombreuses bactéries pathogènes résistent à la digestion amibienne. Elles survivent et prolifèrent à l'intérieur de l'amibe avant d'induire la lyse de la cellule hôte. Les bactéries qui en résultent présentent un phénotype plus résistant et plus virulent. Les amibes favorisent également l'échange de matériel génétique entre les micro-organismes intra-amibiens, y compris les virus. Les amibes libres sont donc décrites comme réservoir et vecteur pour de nombreuses bactéries pathogènes. En condition de stress ou en présence de biocides, les amibes libres se différencient en une forme de résistance appelée kyste. Les bactéries se trouvant dans le kyste sont ainsi protégées des différents traitements. Une meilleure connaissance des mécanismes d'enkystement est donc nécessaire pour favoriser l'élimination des bactéries et de leurs hôtes amibiens. Toutefois, les mécanismes mis en jeu durant l'enkystement sont peu connus. L'objectif du projet AmoCyst est donc d'identifier les voies de signalisations mises en jeu durant l'enkystement dans le but de déterminer d'éventuelles cibles pour le développement de molécules anti-amibiennes. Ce projet est pertinent sur le plan médical et environnemental. En effet, au delà de la pathogénie des amibes libres, la résistance aux amibes est similaire à celle des cellules phagocytaires comme les macrophages. Les bactéries résistantes aux amibes constituent des pathogènes émergents et sont donc potentiellement pathogènes pour l'homme. Pour atteindre notre objectif, une analyse protéomique par spectrométrie de masse nous permettra d'identifier les variations du niveau des protéines ainsi que l'activité protéique durant l'enkystement. Les voies de signalisations impliquées dans l'enkystement seront établies en utilisant des algorithmes d'alignement de réseaux de signalisation afin d'identifier des voies de signalisations et des protéines conservées et/ou spécifiques d'amibes libres. Les voies de signalisation hypothétiques seront validées à travers des expériences d'interactions protéiques et des tests d'activité. Nous étudierons également la contribution des protéines identifiées dans la résistance des amibes libres contre les biocides. Les résultats de ce projet seront valorisés à travers des publications dans des journaux à comité de lecture et des présentations dans des congrès internationaux. Les retombés de ce projet intéresseront également l'industrie de l'eau qui a un besoin urgent de se débarrasser des amibes libres. Le peu de données sur l'enkystement témoigne de l'originalité de ce projet qui offre, pour la première fois, une analyse globale nécessaire à la compréhension de l'enkystement des amibes libres englobant la protéomique, l'étude des fonctions cellulaires ainsi que la sensibilité aux traitements.