Recrutement eIF3-dependant du ribosome par l'ARNm de l'histone H4 – H4translation

Notre laboratoire a montré que la traduction de l’histone H4 (H4 ci-après) combine des caractéristiques canoniques (dépendance vis-à-vis de la coiffe) et la stratégie virale (absence de scanning et recrutement interne des facteurs d'initiation) lors de l’étape d’initiation (Mol. Cell, 2011). L’ARNm H4 contient un élément structural 4E-SE (eIF4E-sensitive element) replié en une double tige-boucle qui recrute le complexe de fixation à la coiffe eIF4F. De plus, l'ARNm H4 contient une structure repliée en jonction à 3 hélices (TWJ) présentant la propriété inhabituelle de bloquer les ribosomes 80S engagés lorsque la traduction cap-dépendante est réprimée. Par cryo-microscopie électronique, nous avons montré que l'ARNm H4 s’appariait avec la boucle de l'hélice 16 de la séquence d'ARN ribosomique 18S, ce qui favorise le bon positionnement de l’AUG initiateur dans le site P du ribosome (Nat. Commun., 2016). Récemment, des expériences de CLIP-SEQ ont montré que l'ARNm de H4 faisait partie d’un groupe d’ARNm cellulaires se liant à eIF3, le plus grand des facteurs d'initiation. Chez les eucaryotes supérieurs, les sous-unités eIF3 s’assemblent en un cœur central appelé PCI contenant 8 sous-unités (a, c, e, f, h, l, k, m) relié à des sous-unités périphériques (b, d, g, i, j). Alors que le cœur présente une structure compacte multilobée similaire aux complexes du protéasome et signalosome, les sous-unités périphériques sont plus dispersées et diffuses, formant un réseau d'interactions encerclant la sous-unité 40S et reliant l'entrée du canal de l'ARNm à sa sortie. Lors de travaux préliminaires, nous avons montré que l'ARNm de l'histone H4 était ponté par les sous-unités d’eIF3 présentes aux deux extrémités du canal de l'ARNm : eIF3b,g à l’entrée et eIF3c,d à la sortie. Sur la base de ces premiers résultats, nous proposons le projet H4translation. Ce projet consiste en 3 tâches visant à comprendre les caractéristiques fonctionnelles et structurales de l'interaction de H4 avec eIF3 et de clarifier les ambiguïtés structurales concernant la localisation de certaines sous-unités d’eIF3 sur le ribosome. (1) Le premier objectif du projet est de décortiquer l'interaction entre H4 et eIF3. Les approches incluront le sondage de l’ARNm, des expériences d’empreinte, des pontages chimiques, des immuno-précipitations et des tests de traduction d’ARNm rapporteurs. La sous-unité eIF3d sera tout particulièrement étudiée car elle présente une activité de fixation de la coiffe qui pourrait jouer un rôle critique dans l’ancrage d’H4 sur le ribosome. Ces travaux établiront les bases moléculaires de l’interaction permettant à eIF3 de sélectionner certains ARNm cellulaires pour les activer ou réprimer. (2) La seconde tâche consistera à améliorer par cryo-microscopie électronique la résolution de la structure de l’ARNm H4 sur le ribosome afin de visualiser les nucléotides impliqués dans l’interaction de H4 avec le ribosome. Par ailleurs, nous optimiserons les protocoles afin de purifier des complexes 48S avec eIF3 et H4. Plusieurs structures de complexes 48S incomplets ont été rapportées dans la littérature, avec une occupation faible et partielle pour certaines des sous-unités périphériques d’eIF3. Nous pensons que l'ARNm H4 est la plateforme idéale pour la formation de complexes grâce à ses séquences internes qui lient eIF3. (3) La troisième tâche consistera à explorer la fonction de l'interaction d’H4 et eIF3 in vivo. Les sous-unités d’eIF3 seront inhibées par ARN interférence et l'effet sur la traduction de l'histone sera mesuré.
Globalement, cette étude apportera une compréhension plus complète du mécanisme « IRES-like » de l'initiation de traduction interne de l'ARNm H4. De plus, le projet complètera la structure du complexe eIF3 sur le ribosome et permettra de comprendre les principes de la régulation qu’il exerce sur certains ARNm cellulaires.