Photolyse un ou deux photons de peptides inhibiteurs cage pour sonder la sécrétion cellulaire et la fonction synaptique in situ. – TP-PEPTIDES
Les interactions protéine-protéine durant la sécrétion de neurotransmetteurs, d’hormones locales, ou d’événements en aval d’une liaison au récepteur, sont difficiles à étudier dans un contexte physiologique. Des acteurs de ces interactions sont connus, leurs dynamiques dans un contexte de physiologie cellulaire sont difficiles à mesurer et par conséquent encore inconnues. Une approche de cette problématique consiste à faire intervenir un peptide inhibiteur, dans une expérience spatialement localisée, et de mesurer l’amplitude des réponses physiologiques au cours du temps. Cette proposition tire profit des essors du «décageage» photochimique et de la chimie des peptides de pénétration cellulaire (CPPs), pour développer des outils pour une analyse résolue dans le temps des interactions protéine-protéine durant la sécrétion cellulaire et la transmission synaptique. Cette approche interdisciplinaire combine différentes expertises : photoexcitation à 1 ou 2 photons, développement et application des CPPs, sécrétion cellulaire et transmission synaptique pour sonder les interactions protéine-protéine lors des processus intracellulaires. Des peptides inhibiteurs ayant des résidus cruciaux «cagés» pour masquer leur activité, et dont l’activité ne sera rétablie qu’après photolyse, seront élaborés. Les CPPs permettront l'accès aux compartiments cellulaires visés; assurant ainsi une précision spatio-temporelle lors de la photolyse sous microscope. Le mise au point de sondes spécifiques nécessite l’optimisation et l’intégration de 3 aspects techniques : (a) les peptides inhibiteurs cagés et couplés à des CPPs seront élaborés pour permettre leur internalisation dans un tissu, en vue d’une libération par photolyse localisée au niveau de la structure d'intérêt ; (b) les groupes cageants, avec des sections efficaces à 2 photons améliorées seront développés ; (c) les inhibiteurs cagés conjugués aux CPPs seront évalués pour leur affinité réduite et inertie biologique/pharmacologique. Peptides de pénétration cellulaire. Le projet développera une vectorisation efficace de peptides bioactifs, la quantification de l’internalisation et l’identification de ses mécanismes par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Des CPPs cycliques, à domaines basiques acylés par des acides gras, seront développés et sélectionnés sur la base de leur internalisation cellulaire par translocation directe. L’identification des éléments structuraux favorisant la translocation cytosolique, en plus des essais fonctionnels des conjugués CPP-Inhibiteurs cagés, conduira à l’élaboration de CPPs plus performants. Photochimie des cages à 1 et 2 photons. Des groupes «cageants» avec une grande section efficace à 1 ou 2 photons, une bonne hydrosolubilité, et adaptés à la protection d’amines, sulfhydryles, alcools ou acides sont en développement autour de la photochimie des diméthylaminoquinoléines. La sécrétion des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales régulent l'homéostasie, l'inflammation, la croissance et réparation des vaisseaux, elles constituent un bon test modèle pour étudier les interactions entre protéines lors de la sécrétion. Les molécules impliquées sont connues, leurs interventions et la microscopie optique requise sont aisément appliquées. Les peptides visés sont, ceux liés à la syntaxin 2, des inhibiteurs de la calmoduline ou de la PKC. La transmission synaptique. Des peptides cagés inhibiteurs du sous-type AMPA des récepteurs glutamate seront utilisés, en extracellulaire, pour distinguer la transmission rapide, d’un seul site, de la transmission lente du débordement multisynaptique et la transmission parasynaptique au niveau des synapses spécifiques dans le cortex cérébelleux. Les peptides cagés qui, après photolyse en intracellulaire, interfèrent avec la localisation des récepteurs au niveau des synapses identifiables, seront utilisés pour mesurer l'évolution temporelle de la force synaptique pendant la stimulation.
Coordination du projet
Peter DALKO (Laboratoire de Chimie et Biochimie)
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Partenariat
UPD-LCB Laboratoire de Chimie et Biochimie
UPD-LPC Laboratoire de Physiologie Cérébrale
LBM CNRS UMR 7203, Laboratoire de Biomolecules, UPMC (PARIS 6)
SGUL St Georges, University of London
Aide de l'ANR 574 829 euros
Début et durée du projet scientifique :
décembre 2016
- 36 Mois