Le complexe Médiateur: d'un réseau d'interactions protéine-protéine à la régulation génique in vivo – MEDNET

L’initiation de la transcription par l’ARN polymérase II (PolII) nécessite un grand nombre d’interactions protéine-protéine, dont les impacts fonctionnels in vivo ont été peu étudiés. Un acteur clef est le Médiateur (MED), un complexe multiprotéique conservé servant d’interface physique et fonctionnelle entre les facteurs de transcription (FTs) liés à l’ADN et la machinerie basale PolII.

En dépit d’un rôle général du MED dans la transcription, certaines sous-unités (SUs) ont des fonctions étonnamment spécifiques, comme en atteste les maladies humaines associées à leurs dysfonctionnements. Ainsi, des mutations de Med13 sont associées à des retards mentaux tandis que Med19 est surexprimée dans une majorité de cancers. La spécificité des SUs MED résulte en partie de leur capacité à lier des FTs, mais la nature de ces interactions et leurs rôles dans la régulation génique in vivo, restent encore mal compris.

Une autre boite noire réside dans la régulation de l’assemblage du MED, notamment l’ancrage du module ‘’CKM’’. Ce module composé de 4 SUs dont l’association avec le complexe cœur induit la répression de la transcription, a été impliqué plus récemment dans la régulation de l’activation. Identifier les liens moléculaires entre le CKM et le complexe cœur est donc crucial pour comprendre son rôle régulateur

Il a été proposé que l’ancrage du CKM se fasse via une interaction entre sa SU Med13 et la SU Med19 située au sommet du complexe cœur. Par ailleurs, chez la drosophile, Med19 agit comme cofacteur de FTs de type GATA et de type HOX interagissant directement avec leur domaine de liaison à l’ADN. Ainsi, Med19 semble unique par sa capacité à servir dans le MED de plateforme d’ancrage pour les FTs d’une part et pour le CKM de l’autre. Il reste néanmoins à caractériser ces partenariats sur le plan moléculaire et à tester leur relevance fonctionnelle in vivo.

Ce projet propose de combiner les intérêts de H.M. Bourbon (Partenaire#1) et V. Villeret (Partenaire#2) pour le MED et de joindre leur expertise respective en génétique du développement et biologie structurale pour décrypter les mécanismes d’action du MED. Il réside en une analyse structure-fonction détaillée d’une SU MED clef, Med19, depuis la caractérisation de déterminants structuraux impliqués dans des partenariats spécifiques jusqu’à l’analyse de leur importance fonctionnelle dans un organisme modèle.

Trois questions seront adressées:

(1) Décrypter les déterminants moléculaires de Med19 impliqués dans les interactions directes avec les GATAs et le CKM, grâce à des tests d’interaction in vitro et in vivo et des analyses structurales à une résolution atomique (Cristallographie et RMN).
(2) Disséquer la fonction de ces partenariats moléculaires sur l’expression génique in vivo. Grâce à la technique CRISPR-Cas9 récemment développée chez la drosophile, nous générerons des mutations ponctuelles des résidus préalablement caractérisés, permettant les contacts Med19-GATA et Med19-CKM et analyserons leurs conséquences fonctionnelles, par des analyses phénotypiques, transcriptomiques et d’immuno-précipitation de chromatine.
(3) Explorer la conservation structurale des partenariats de Med19 et leur relevance dans les maladies humaines. Pour cela, nous analyserons (i) la conservation chez l’homme des interactions Med19-CKM et Med19-GATA et déduirons le cas échéant, la structure des surfaces d’interaction chez l’homme à partir des données obtenues chez la drosophile, (ii) l’étendue des interactions entre Med19 et les FTs chez l'insecte et chez l’homme et (iii) l'implication potentielle des partenariats de Med19 dans des maladies chez l'homme.

L’originalité de notre projet résulte d’approches multidisciplinaires combinant des études structurales au niveau atomique et des analyses in vivo à l’échelle du génome entier. Il devrait procurer une vaste connaissance sur la spécificité fonctionnelle des SU MED et aidera à comprendre leurs liens avec des maladies humaines.