Analyse fonctionnelle de la réorganisation nucléaire – FANR

L’organisation tridimensionnelle du génome est un facteur important pour la régulation de la transcription et est souvent dérégulée dans les maladies telles que les cancers. Par son rôle direct sur la répression de la transcription, la périphérie nucléaire est un élément clé de l’architecture nucléaire. Une réorganisation nucléaire globale a lieu lors de la différenciation des cellules souches (ESCs) entrainant le déplacement de 1600 gènes en fonction de la régulation de leur transcription. Néanmoins, les mécanismes responsables du mouvement des gènes sont encore mal compris. Nous avons récemment montré que la compaction de la chromatine est déterminante pour la relocalisation des gènes et dans la mémoire du positionnement. Mais les protéines impliquées et la dynamique de ces processus restent inconnues.
Notre premier objectif est d’élucider le rôle du variant d’histone H3.3 et de Pml dans la réorganisation nucléaire au cours de la différenciation. L’incorporation de H3.3 induit une décompaction de la chromatine in vitro et est impliqué dans la mémoire de la transcription. Nos résultats préliminaires indiquent que le repositionnement des gènes est corrélé à un changement du niveau de H3.3, suggérant un rôle important pour ce variant. Les deux chaperonnes de H3.3, Hira et Daxx s’accumulent dans les corps Pml. Or, au cours de la différenciation des ESCs, les corps nucléaires Pml se réorganisent et libèrent Daxx et Hira dans le nucléoplasme. Cette augmentation nucléoplasmique de chaperonnes pourrait participer aux changements quantitatifs de H3.3 observés lors du mouvement des gènes durant la différenciation. De plus, ces corps Pml modifiés colocalisent alors avec l’incorporation de la Lamin A, un des points d’ancrage de la chromatine. Nous proposons d’étudier l’importance de Pml et de H3.3 pour la réorganisation nucléaire et la mémoire épigénétique du positionnement des gènes dans les cellules ESC et différenciées. Dans un premier temps, nous étudierons si les repositionnements des gènes ont lieu au cours de la différenciation de ESCs Pml-/- et s’ils sont corrélés à la quantité de H3.3 ou l’incorporation de Lamin A. Les siRNA dirigés contre H3.3 nous permettrons de confirmer nos résultats préliminaires montrant le rôle essentiel du variant pour le maintien du positionnement central des gènes. Nous testerons si le recrutement de H3.3 est suffisant pour induire le mouvement des gènes en recrutant Hira et Daxx à des promoteurs endogènes grâce à des fusions de ces protéines avec des TALEs.
Notre second objectif est de tester la fonction biologique du mouvement des gènes au cours du développement. Nous commencerons par ancrer le gène endogène Nrp1 à la périphérie du noyau grâce à la fusion de TALEs avec une protéine de l’enveloppe nucléaire. L’ancrage de Nrp1 empêchera son déplacement vers le centre du noyau au cours de la différenciation. Nous pourrons ainsi déterminer si le mouvement de Nrp1 est important pour l’activation de sa transcription et le bon déroulement de la différenciation.
Dans son ensemble, notre projet permettra de mieux comprendre comment et pourquoi les gènes se déplacent au cours du développement. Les résultats obtenus devraient améliorer également la compréhension du lien existant entre cancers, compaction de la chromatine et une organisation anormale du noyau.