Nanoparticules polymériques fluorescentes ultrabrillantes et biocompatibles pour l’imagerie rapide intracellulaire à haute-résolution – supertrack

L'imagerie de fluorescence de biomolécules individuelles dans des cellules vivantes devient une technique clé pour la compréhension de processus biologiques à l'échelle moléculaire. Ceci nécessite de localiser des émetteurs individuels avec une très haute résolution temporelle et spatiale. La résolution dépend fortement des marqueurs fluorescents. Plus un émetteur est brillant, plus la précision de localisation est grande pour un temps d'acquisition donné. En outre, il est possible de différencier des émetteurs à des distances en-dessous de la limite de diffraction grâce à des techniques de super-résolution comme la dSTORM, si les émetteurs montrent une intermittence de fluorescence (un clignotement). En revanche, ceci rend le suivi des émetteurs plus difficile. La limite de brillance des fluorophores organiques et des protéines fluorescentes peut être dépassée par des nanoparticules (NPs) fluorescentes. Notamment les NPs polymériques fluorescentes suscitent actuellement un grand intérêt grâce à leur polyvalence, biocompatibilité et potentiel à dépasser les limites des quantum dots en terme de brillance et de contrôle de clignotement. Nous avons montré récemment que l´encapsulation d'un sel fluorophore/contre-ion hydrophobe dans des NPs polymériques permet d'améliorer leur brillance et peut induire un comportement collectif menant à un clignotement de la particule entière.
Dans ce projet, nous allons développer de très petites NPs polymériques fluorescentes ultrabrillantes adaptées au suivi intracellulaire très rapide de biomolécules individuelles à très haute résolution.
L'approche la plus directe pour obtenir des NPs fluorescentes polymériques est leur dopage avec des fluorophores. Dans ces systèmes, le 1er défi est d'obtenir une très grande brillance car les fluorophores ont tendance à se désactiver à des concentrations élevées. Un 2ème défi est que le clignotement nécessaire pour la super-résolution nécessite la coopérativité de centaines de fluorophores. Dans ce projet, nous allons utiliser l'encapsulation de sel de dérivés de la rhodamine B avec des contre-ions volumineux hydrophobes dans des NPs polymériques pour créer des NPs ultrabrillantes ayant un clignotement contrôlé. A cette fin, nous allons contrôler l'organisation des fluorophores dans les NPs en variant l'hydrophobicité du polymère et du sel du fluorophore ainsi que les conditions d'assemblage.
Pour l'utilisation de NPs comme sondes intracellulaires, il est en plus nécessaire que leur taille soit du même ordre de grandeur que celle des protéines marquées, et d'empêcher leur agrégation et interaction non-spécifique avec des composantes cellulaires. Dans ce projet, nous allons introduire des groupements chargés et zwitterioniques dans des polymères. Leur nanoprécipitation devrait conduire à des NPs très petites ayant la coque résistant aux interactions la plus fine possible. L'étude des interactions de ces NPs à l'intérieur de cellules et leur optimisation conduira à des NPs <10 nm capables de se déplacer librement à l'intérieur de cellules.
Nous allons valider ces NPs en les utilisant pour suivre directement la dynéine cytoplasmique, un moteur moléculaire, dans des cellules de mammifères, ce qui nécessite une haute vitesse et résolution. Dans ce but, des NPs portant des groupements benzyl guanine vont être introduites dans des cellules exprimant la dynéine-SNAP-tag afin d'obtenir son marquage. Les NPs vont ensuite être imagées en combinant des techniques de vidéomicroscopie et de dSTORM en 3D. En ajustant le clignotement des NPs, nous pourrions ainsi suivre des dynéines dans des cellules vivantes, distinguer des dynéines individuelles et donc obtenir des informations sur leur colocalisation et cooperativité.
Les NPs développées ici pourront donc, grâce à leur taille, leurs propriétés de surface, leur brillance et le contrôle de leur clignotement, ouvrir le chemin au suivi rapide à haute résolution de biomolécules individuelles à l'intérieur de cellules.