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Nouveau Médicament de Thérapie Innovante pour le traitement des lésions cartilagineuses composé de cellules stromales mésenchymateuses issues de la Gelée de Wharton et d’une matrice intelligente associées extemporanément – ATYPiCAL

ATYPiCAL

Nouveau Médicament de Thérapie Innovante pour le traitement des lésions cartilagineuses composé de cellules stromales mésenchymateuses issues de la Gelée de Wharton et d’une matrice intelligente associées extemporanément

Culture de CSM-GW en condition de grade clinique, Ensemencement dans une matrice stratifiée pour observer la différenciation chondrocytaire et étudier le maintien des propriétés immunomodulatrices

Les enjeux de ce projet sont: <br />1. d’utiliser des CSM-GW allogéniques produites en grade clinique : à ce jour 8 productions sur les 12 prévues dans le projet ont été réalisées <br />2. d’utiliser une matrice innovante stratifiée fonctionnalisée ou non avec de la BMP2, associée aux CSM-GW (CSM-GW/Alg-HA, CSM-GW/Alg-HA/Nano-M1 +/-BMP2) et de vérifier son impact sur la différenciation chondrogénique. En parallèle, nous souhaitons étudier le devenir des propriéts immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la différenciation chondrocytaire dans les différentes conditions. Une première manipulation a été initiée avec une production de CSM-GW qui a mis en lumière les problèmes techniques et logistiques rencontrés et a permis d'affiner la coordination entre les différents partenaires. <br />3. de vérifier que la réaction immunitaire observée dans un contexte allogénique n'interfère pas négativement avec la différenciation chondrogénique. Le contexte allogénique a été mimé par l'ajout pendant 24h d'IFNg et de TNFa. Les résultats préliminaires obtenus ne montrent aucune différence de comportement en présence ou en l'absence de cytokines. <br />4. de valider in vivo que les constructions réalisées permettent d'obtenir une différenciation chondrogénique, le maintien des propriétés immunomodulatrices et de valider également la biocompatibilité. Cette étape n'a pas été initiée.

La production de CSM-GW nécessite des locaux conformes aux Bonnes Pratiques de Fabrication pharmaceutique et les milieux de cultures ainsi que les matériels utilisés doivent être disponibles pour un usage clinique.
La cytométrie en flux avec ou sans marquage intra-cytoplasmique a été réalisée, des échantillons ont été cryopréservés pour la réalisation ultérieure d'ELISA et les cultures mixtes lymphocytaires ont été réalisées dans un contexte inhabituel puisque les puits contenaient des inserts avec la matrice plus ou moins ensemencée avec les CSM-GW et à différents temps de la différenciation chondrocytaire.
Pour la différenciation chondrogénique, l'analyse par cytométrie en flux a été rélaisée, les échantillons pour l'histologie et les analyses de biologie moléculaire ont été préparés et conservés afin d'être analysés de façon groupée avec les échantillons issus d'autres manipulations.
Les inserts avec la membrane Nano-M1 ont été produits par la société ARTiOS Nanomed selon un procédé de production protégé par un brevet.

Les principaux résultats générés par ce projet ANR sont à l'heure actuelle :
- la définition de critères de sélection des cordons ombilicaux afin de choisir ceux présentant le meilleur potentiel de prolifération et de différenciation chondrogénique. Ce travail a fait l'objet d'une publication récente (cf ci-dessous) et a permis dans la suite du projet d'appliquer ces critères de sélection.
- La génération de CSM-GW de grade clinique : 8 cordons ombilicaux ont été collectés et les CSM-GW générées jsuqu'à aujourd'hui. Les cellules ont été cryoconservées. Le procédé de Capelli et al a été adapté et optimisé.
- L'utilisation de réactifs utilisables en clinique nous a amené à réaliser des contrôles notamment pour l'Alginate dont on sait que la viscosité est un paramètre critique pour la différenciation chondrocytaire et est altérée par les processus de stérilisation. De plus, le procédé de gélification, différent que celui utilisé à l'échelle de la recherche, a été validé.
- Des résultats encourageants ont été observés lors de la première manipulation : (i) la différenciation chondrogénique a été objectivée par la forte expression des collagènes II, (ii) la faible ou l'absence d'expression des molécules de co-stimulation ainsi que la détection de facteurs comme IDO, HLA-G et PDL-1 même à la fin de la différenciation chondrogénique, (iii) la non immunogénicité et le maintien des propriétés immunomodulatrices jusqu'à J14, les résultats à J30 étant difficilement interprétables du fait de problèmes techniques.

Les perspectives sont:
- bien sûr de terminer l'analyse de cette première manipulation qui a permis de rôder la coordination entre les différents partenaires
- de réaliser les manipulations à partir des CSM-GW cryoconservées avec les autres souches de cordon afin de confirmer ces résultats préliminaires.
- de compléter les analyses qui n'ont pas encore été envisagées : avec la membrane Nano-M1 fonctionnalisée par la BMP2, l'étude des T régulateurs, etc...
- de préparer les manipulations in vivo.

Publication :
Umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells: predictive obstetric factors for cell proliferation and chondrogenic differentiation.
Avercenc-Léger L, Guerci P, Virion JM, Cauchois G, Hupont S, Rahouadj R, Magdalou J, Stoltz JF, Bensoussan D, Huselstein C, Reppel L.
Stem Cell Res Ther. 2017 Jul 5;8(1):161.

Le développement des techniques d’ingénierie tissulaire permet aujourd’hui d’envisager à moyen terme l’utilisation clinique de greffes ostéo-articulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses (CSM) et la préparation de biocartilage. Du fait de leurs capacités de prolifération et de différenciation, ces CSM semblent être, actuellement, une des voies les plus prometteuses d’obtention de cellules cartilagineuses. Le tissu conjonctif du cordon ombilical ou gelée de Wharton (GW) constitue une source de CSM abondante et intéressante pour des applications cliniques. Elles semblent plus immatures sur le plan immunologique et ont un potentiel de prolifération plus élevé que les CSM de tissus adultes. Tous ces avantages font de la GW une source particulièrement intéressante en particulier pour les thérapies d’ingénierie tissulaire devant se placer dans un contexte allogénique. Cependant, les propriétés immunomodulatrices des CSM-GW doivent être définies précisément pour pouvoir être utilisées comme Médicaments de Thérapie Innovante (MTI) conformément à la réglementation européenne (1394/2007).
Le projet ATYPiCAL s'inscrit dans une demande de financement auprès de l'agence ANR-PRCE 2015 et propose une stratégie innovante qui consiste en l’association extemporanée de CSM-GW encapsulées au sein d’une matrice stratifiée composée d’une couche d’Alginate/Acide hyaluronique (Alg/HA) afin de guider la différenciation chondrogénique et d’une membrane ostéo-inductrice NanoM1 (société ARTiOS) pour la régénération de l’os sous-chondral. L’une des conséquences est alors l’apport en ingénierie tissulaire de cellules allogéniques.
L'originalité de ce présent projet repose sur le fait:
(i) de réaliser un transfert technologique de la recherche (UMR 7365 et le Laboratoire d’Immunologie de la Transplantation du CEA) vers la clinique (UTCT). Ce transfert consiste à adapter une méthode d’isolement, de production et de conservation de CSM-GW mise au point au sein de l’UMR 7365 à des conditions de grade clinique à l’UTCT. L’amplification des CSM se fera jusqu’au 3ème passage et sera suivie d’un contrôle qualité développé par l’UMR 7365 et le Laboratoire d’Immunologie de la Transplantation du CEA (auto-renouvellement et stabilité phénotypique, stabilité génétique et vieillissement cellulaire, potentiel de différenciation, propriétés immunomodulatrices). Afin de produire des CSM-GW de grade clinique en respectant la réglementation française actuelle dans le domaine des MTI, la culture de cellules sera réalisée avec un milieu de culture enrichi en lysat plaquettaire humain afin de s’affranchir de la présence de protéines animales,
(ii) de confirmer, in vitro et in vivo, la qualité de la différenciation chondrocytaire obtenue au sein d’une structure stratifiée à base d’Alg/HA et de la membrane ostéo-inductrice NanoM1 (INSERM UMR 1109),
(iii) de caractériser, in vitro et in vivo, les propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la différenciation chondrogénique à partir de tests fonctionnels,
(iv) d’évaluer, in vitro, l’impact d’une réaction immunitaire observée dans un contexte allogénique sur la différenciation chondrocytaire des CSM-GW.

Les résultats attendus doivent permettre d’évaluer la faisabilité de cette approche d'ingénierie tissulaire et de valider la technique d’amplification de grade clinique des CSM-GW ainsi que d’obtenir des CSM-GW finement caractérisées et sécurisées. Ce projet permettra, à terme, de diversifier le champ des MTI en France mettant en application un savoir-faire indispensable au progrès thérapeutique.

Coordinateur du projet

Madame Danièle Bensoussan (Bioingénerie Moléculaire Cellulaire et Thérapeutique - FR3209)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

BMCT - FR 3209 Bioingénerie Moléculaire Cellulaire et Thérapeutique - FR3209
IMoPA Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire
CEA-DSV-IMETI Service de Recherches en Hemato-Immunologie
INSERM UMR1260 Osteoarticular and Dental Regenerative Nanomedicine
ARTIOS NANOMED

Aide de l'ANR 621 031 euros
Début et durée du projet scientifique : novembre 2015 - 48 Mois

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