Ancrage des corps basaux pendant la ciliogenèse : analyse structure-fonction – ANCHOR

1) identifier de nouvelles protéines impliquées dans le processus d’ancrage en utilisant la technique de biotinylation in vivo
(BioID) de protéines à proximité des protéines cibles et disséquer leur interactions fonctionnelles
2) utiliser la microscopie électronique afin d’étudier à l’échelle nanométrique les mécanismes structuraux sous-jacents à la formation
de la zone de transition (Cryo-tomographie)

Mise au point au laboratoire de la technique de BioID. Cette techniqque a permis d'identifier de nouveaux partenaires à proximité de la protéine appât. Ces partenaires sont en cours d'analyse fonctionnelle.
Nous avons montré que la déplétion de protéines du modules MKS induisent une déciliation spontanée alors que la déplétion des protéines NPHP4, Cep290 et RPGRIP1L empèche ce processus. Nos résultats montrent pour la première fois le rôle conservé des protéines de la zone de transition dans les mécanismes de deciliation et ouvre de nouvelles perspectives de la compréhension des cils motiles.
L'observation des tomogrammes a permis de déterminer les faits suivants: le C-tubule se termine au-delà de la zone de transition. Nous avons montré que les fibres de transition sont formées à partir du B-tubule, et adopte un fort twist.Nous abservons des «queues de cerise « qui pourrait être les fameux Y-links.

La combinaison de méthodes transcriptomiques, biochimiques et ultrastructurales doivent permettre de déterminer le réseau d'interaction nécessaire à l'ancrage des corps basaux et de clarifier l'assemblage de la zone de transition.Le grand nombre de corps basaux chez la paramécie, couplé à des méthodes simples de RNAi et de purification des unités corticales doit donner des résultats originaux, c'est à dire en particuliers permettre de déterminer les mécanismes d'assemblage de la zone de transition dans un espace 4D. Comme la zone de transition chez la paramécie varie en fonction du statut de ciliation, les résultats pourrait servir de base à la compréhension des changements structuraux associés à la formation du cil.

Bengueddach, H., Lemullois, M., Aubusson-Fleury, A., and Koll, F. (2017). Basal body positioning and anchoring in the multiciliated cell Paramecium tetraurelia: roles of OFD1 and VFL3. Cilia 6, 6. (P1)

Tassin, A.-M., Lemullois, M., and Aubusson-Fleury, A. (2016). Paramecium tetraurelia basal body structure. Cilia 5, 6. (P1)

Le cil est un organite cellulaire très conservé au cours de l’évolution, doté de motilité et de fonctions sensorielles. Chez les organismes multicellulaires, cette antenne cellulaire intervient dans de nombreux processus physiologiques et développementaux parmi lesquels la régulation de l’embryogenèse, la tumorigenèse, les fonctions rénales, la vision et l’odorat. En conséquence, des défauts de formation ou de fonction des cils conduisent à des affections patho-physiologiques (ciliopathies) entrainant de nombreuses manifestations cliniques. La ciliogenèse proprement dite est un processus complexe qui comporte la duplication et maturation d’un centriole, sa migration puis son ancrage à la surface cellulaire. Alors que la duplication des centrioles est maintenant bien connue, les étapes suivantes sont l’objet de recherches actives. L’ancrage du corps basal implique de nombreux partenaires: le corps basal, une membrane (membrane plasmique ou vésicule) et des éléments du cytosquelette qui guident le corps basal et coordonnent les opérations. L’interaction d’une membrane avec le corps basal conduit à la formation d’une zone de transition. Cette structure, localisée entre le corps basal et le cil, sert de filtre entre le compartiment cellulaire et ciliaire. De nombreuses protéines impliquées dans des ciliopathies y sont localisées.
L’objectif principal de notre projet est de comprendre les mécanismes régulant l’ancrage du corps basal et la formation de la zone de transition. La paramécie, organisme unicellulaire couvert de cils assemble à chaque cycle cellulaire des milliers de corps basaux près de la surface cellulaire selon une séquence spatio-temporelle très précise. Elle exprime de nombreuses protéines conservées au cours de l’évolution, faisant de cet organisme un modèle d’étude remarquable. Les mécanismes d’ancrage du corps basal peuvent y être facilement étudiés par des approches biochimiques et ultrastructurales. L’utilisation de techniques de RNAi, associées à l ‘expression de protéines étiquetées par la GFP et à la microscopie électronique à faible résolution, nous a permis de démontrer chez la paramécie que la centrine2, OFD1, FOR20 et centrine3 et étaient séquentiellement requises pour la formation de la zone de transition et l’ancrage du corps basal. Ces résultats indiquent que le processus d’ancrage est concomitant à l’assemblage structural de la zone de transition. Chez les mammifères, la régulation du processus d’ancrage par des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination, a récemment été décrite par notre groupe, révélant un niveau supplémentaire de complexité.
Nous voulons tout d’abord disséquer chez la paramécie le recrutement spatio-temporel de protéines impliquées dans l’ancrage des corps basaux ainsi que les mécanismes associés à la formation de la zone de transition. Les données issues de cette étude seront appliquées aux cellules de mammifères.
Aussi utiliserons-nous des approches multi-disciplinaires combinant des techniques de biochimie et de biologie cellulaire avec des techniques ultrastructurales à haute résolution (cryo-tomographie électronique et STEM). Nous allons : 1) identifier de nouvelles protéines impliquées dans le processus d’ancrage en utilisant la technique de biotinylation in vivo (BioID) de protéines à proximité des protéines cibles et disséquer leur interactions fonctionnelles; 2) réaliser un crible transcriptomique afin de rechercher des partenaires supplémentaires impliqués dans ce processus ; 3) utiliser la microscopie électronique afin d’étudier à l’échelle nanométrique les mécanismes structuraux sous-jacents à la formation de la zone de transition.
L'ensemble des données obtenues dans cette étude devrait permettre une analyse 4D (temps-espace) du processus d’ancrage et une meilleure compréhension des défauts ciliaires chez l’homme.