DS0304 - Chimie Durable, produits, procédés associés

Outils chimiques innovants pour la synthèse de peptides riche en ponts disulfure , une classe émergente de molécules d'intêrêt thérapeutique – EasyMiniProt

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Outils chimiques innovants pour la synthèse de peptides riches en disulfure, une classe émergente de médficaments

Enjeux et objectifs

Les peptides riches en ponts disulfure (DRPs) forment un groupe incroyablement diversifié de produits naturels bioactifs (des millions de séquences). Ces peptides polycycliques à conformation contrainte sont composés de 10 à 90 acides aminés (aa) dont plus de 10% de cystéines impliquées dans des ponts disulfure. Beaucoup de ces miniprotéines ont été identifiées comme ligands puissants et sélectifs de récepteurs étant des cibles majeures pour des applications thérapeutiques ou diagnostiques. Un nombre croissant de DRPs, d'origine naturelle ou obtenus par ingénierie, sont actuellement en essais cliniques ou sont récemment entrés sur le marché. <br /> <br />Si les DRPs de petite taille (<30 aa) peuvent être synthétisés par synthèse peptidique en phase solide (SPPS) classique, la synthèse de DRPs plus longs représente encore un réel défi. La plupart des efforts actuels se concentrent sur leur production par synthèse convergente en phase liquide, via des couplages chimiosélectifs de segments peptidiques non protégés par la réaction de ligation chimique native (NCL). Mais ces approches n’ont qu’un très faible débit et sont compliquées par de nombreuses étapes de purification chromatographique. Cela limite et ralentit les études pharmacologiques et les applications. <br /> <br />Le projet EasyMiniProt est centré sur le développement de technologies pour la synthèse de DRPs à un débit beaucoup plus élevé que les méthodes existantes.

Un aspect clé pour intensifier les procédés actuels repose sur la réalisation des ligations chimiosélectives des segments peptidiques sur un support solide, afin de considérablement réduire le nombre d'étapes intermédiaires de purification par HPLC. L'assemblage des miniprotéines dans la direction opposée à celle de la SPPS présente un avantage additionnel d’«auto-purification«, permettant l'utilisation de segments peptidiques bruts. Deux méthodes distinctes de ligation seront exploitées : la ligation native et la ligation triazole peptidomimétique développée par le partenaire 1. Le repliement oxydatif pour former régiosélectivement les ponts disulfure peut être un facteur limitant: si les DRPs d’origine naturelle peuvent la plupart du temps être replié sous contrôle thermodynamique, ceci implique l'utilisation de conditions très diluées. Nous allons exploiter le support solide utilisé pour leur synthèse pour cette étape de repliement. Une approche originale basée sur des fragments avec des ponts disulfure préformés sera également mise en œuvre.

Enfin, les méthodes développées seront appliquées à la génération d'un grand nombre de variants diversifiés d'un DRP, la toxine muscarinique 7 du venin de mamba, qui est particulièrement prometteuse d'un point de vue thérapeutique. En particulier, nous allons utiliser une approche innovante de combinaison par fragments. Nous nous attendons à identifier plusieurs variants avec des profils pharmacologiques inédits.

Une dizaine de nouveaux catalyseurs de type NHC-Cu(I) hydrosolubles de seconde génération ont été synthétisés, puis évalués dans le cadre de réactions de cycloaddition d’azotures et d’alcynes modèles, en milieu aqueux et dilué (<1mM) et dans des conditions non désoxygénée. De façon décevante, ces nouveaux catalyseurs ne sont pas plus réactifs que le catalyseur de première génération (Chem Comm 2012), et ne sont donc pas adaptés à la CuAAC de peptides riches en cystéines. En revanche, un système très prometteur de catalyse en conditions micellaire a été identifié, permettant des réactions rapides de petits peptides modèles dans des conditions aqueuses très diluées (10 µM).

Nous avons rigoureusement évalué l’efficacité du dispositif N-Hnb-Cys en le comparant à une réaction classique de NCL mettant en œuvre un thioester d’alkyle préformé. Ces travaux ont en effet mis en évidence une efficacité supérieure aux systèmes existants fondés sur un transfert d’acyle N-S (facteur <10 en terme de cinétique), mais restant relativement lent (cinétique environ 5 fois plus lente à pH 7.5) qu’une NCL classique.

Le développement d’un nouveau bras N-terminal incorporant une cystéine plutôt qu’un groupement azoture a été mené à bien. Ce bras peut être synthétisé en quelques étapes avec de bons rendements, et sa stabilité comme ses conditions optimales de coupure ont été rigoureusement évaluées.

Nous avons exploré la possibilité d’utiliser des catalyseurs classiques de CuAAC pour a synthèse de triazolo-DRPs, selon une stratégie fondée sur l’utilisation de groupements protecteurs des cystéines. De sérieux écueils ont étés rencontrés concernant la compatibilité de ces groupements protecteurs avec les catalyseurs classiques, mais aussi de la déprotection très délicate de ces groupements protecteurs après ligation. En l’attente de l’optimisation de nouveaux systèmes catalytiques, une stratégie efficace de synthèse de MT7 en solution via deux NCLs successives a pu être mise au point.

Le système très prometteur de catalyse en conditions micellaire qui a été identifié va prochainement être évalué dans le cadre de la réaction de longs peptides, y compris les modèles incorporant de nombreuses cystéines cités dans le document du projet (en particulier MT7). Une attention particulière sera ensuite portée à l’évaluation de la compatibilité de ces systèmes avec des réactions sur support solide.

Le développement d’une stratégie permettant d’adapter notre méthodologie de synthèse de peptides crypto-thioesters à de multiples ligations successives de N-vers-C a été initié, et va être activement poursuivi dans les prochains mois. Différents groupements protecteurs de la cystéine (Acm, PhAcm, Mob, Nv) du dispositif de thioesterification intramoléculaire N-Hnb-Cys résistants à des conditions de NCL ont étés évalués, et des conditions très prometteuses de déprotection du groupement Acm (PdCl2) ont pu être mises en évidence.

Nos efforts expérimentaux et théoriques (partenaire 2/modélisation moléculaire) sont actuellement concentrés sur (1) la compréhension fine des mécanismes moléculaires sous-jacents et (2) la conception raisonnée d’un dispositif de seconde génération. Ce travail a porté ses fruits, puisque nous avons maintenant en main un nouveau dispositif capable de réactions de ligation bien plus rapides et d’apporter des réponses convaincantes aux questionnements mécanistiques relatives au dispositif N-Hnb-Cys qui est au cœur du projet EasyMiniProt. Le travail devant mener à une première publication commune exploitant pleinement les synergies des trois partenaires est en court de finalisation, comprenant également l’exploitation de ce dispositif de seconde génération pour la synthèse de notre DRP modèle MT7 via la ligation de trois fragments en solution par une stratégie C-vers-N optimisée par le partenaire 3.

Publications:

1. M. T. Jacobsen, X. Ye, M. E. Petersen, M. Galibert, G. S. Lorimer, V. Aucagne, M. S. Kay. A helping hand to overcome solubility challenges in chemical protein synthesis. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 11775-11782. [sélectionné par les éditeurs pour un Spotlight : « Helping hand dissolves tough peptides for protein synthesis » J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 13083-13084]
2. G. Martinez, J.-P. Hograindleur, S. Voisin, R. Abi Nahed, T. M. Abd El Aziz, J. Escoffier, J. Bessonnat, C.-M. Fovet, M. De Waard, S. Hennebicq, V. Aucagne, P. F. Ray, E. Schmitt, P. Bulet, C. Arnoult. Spermaurin, a La1-like peptide from the venom of the scorpion Maurus palmatus, improves sperm motility and fertilization in different mammalian species. Mol. Hum. Rep., 2017, 23, 116-131.
3. P. Kessler, P. Marchot, M. Silva D. Servent. The three-finger toxin fold: a multifunctional structural scaffold able to modulate the cholinergic functions J. Neurochem. (2017) 10.1111/jnc.13975

Communications orales:

1. M. T. Jacobsen, M. E. Petersen, V. Aucagne, M. S. Kay. A helping hand to overcome solubility challenges in chemical protein synthesis with application to GroES. Third Chemical Ligation Meeting (Lill’gation), 05/2016, Lille.
2. A. Casas-Mora, M. Galibert, A. F Delmas, V. Aucagne. A non-chromatographic catch-and-release purification method to simplify the synthesis of cysteine-rich peptides. 20ème réunion du Groupe Français des Peptides et Protéines (GFPP 20), 03/2017, Arcachon.
3. V. Aucagne. Simplifier la synthèse de miniprotéines riches en ponts disulfure. 7ème Symposium Français de Synthèse Totale (SFST7), 06/2017, Orsay.

+ 5 posters

Les peptides riches en ponts disulfure (DRPs) forment un groupe incroyablement diversifié de produits naturels bioactifs (des millions de séquences). Ces peptides polycycliques à conformation contrainte sont composés de 10 à 90 acides aminés (aa) dont plus de 10% de cystéines impliquées dans des ponts disulfure. Beaucoup de ces miniprotéines ont été identifiées comme ligands puissants et sélectifs de récepteurs étant des cibles majeures pour des applications thérapeutiques ou diagnostiques. Un nombre croissant de DRPs, d'origine naturelle ou obtenus par ingénierie, sont actuellement en essais cliniques ou sont récemment entrés sur le marché.

Si les DRPs de petite taille (<30 aa) peuvent être synthétisés par synthèse peptidique en phase solide (SPPS) classique, la synthèse de DRPs plus longs représente encore un réel défi. La plupart des efforts actuels se concentrent sur leur production par synthèse convergente en phase liquide, via des couplages chimiosélectifs de segments peptidiques non protégés par la réaction de ligation chimique native (NCL). Mais ces approches n’ont qu’un très faible débit et sont compliquée par de nombreuses étapes de purification chromatographique. Cela limite et ralentit les études pharmacologiques et les applications.

Ce projet est centré sur le développement de technologies pour la synthèse de DRPs à un débit beaucoup plus élevé que les méthodes existantes. Un aspect clé pour intensifier les procédés actuels repose sur la réalisation des couplages chimiosélectifs des segments peptidiques sur un support solide, afin de considérablement réduire le nombre d'étapes intermédiaires de purification par HPLC. L'assemblage des miniprotéines dans la direction opposée à celle de la SPPS présente un avantage additionnel d’"auto-purification", permettant l'utilisation de segments peptidiques bruts. Nous allons évaluer plusieurs méthodes en parallèle sur un ensemble de DRPs représentatifs:

(1) Une méthode entièrement basée sur NCL. Cela implique une stratégie pour masquer temporairement la réactivité du thioester pour empêcher la cyclisation ou l’oligomérisation des segments. Cette approche offre l'avantage de n’utiliser que deux types de réactions, la NCL et le démasquage, ce qui est particulièrement intéressant pour une automatisation future du processus. Le principal goulot d'étranglement de la NCL est la synthèse des partenaires peptides thioesters. Nous avons développé une méthodologie très simple et efficace qui sera utilisée tout au long du projet.

(2) Afin de minimiser le nombre d'étapes synthétiques en supprimant la nécessité de masquage, nous exploiterons une combinaison de trois réactions chimiosélectives différentes utilisées en alternance: NCL, cycloaddition azoture / alcyne promue par tension de cycle (SPAAC) ou catalysée par le cuivre (CuAAC). Ces réactions seront utilisées pour greffer le premier segment sur un support solide puis pour l’élongation par ligation. Nous mettrons en œuvre notre approche originale de ligation triazole peptidomimétique (PTL) exploitant le triazole produit par la CuAAC comme mime de liaison amide.

(3) Le repliement oxydatif pour former régiosélectivement les ponts SS peut être un facteur limitant: si les DRPs d’origine naturelle peuvent la plupart du temps être replié sous contrôle thermodynamique, ceci implique l'utilisation de conditions très diluées. Nous allons exploiter le support solide utilisé pour leur synthèse pour cette étape de repliement. Une approche originale basée sur des fragments avec SS préformés sera également mis en œuvre.

Enfin, les méthodes développées seront appliqués à la génération à haut débit d'un grand nombre de variants diversifiés d'un DRP, la toxine muscarinique 7 du venin de mamba, qui est particulièrement prometteuse d'un point de vue thérapeutique. En particulier, nous allons utiliser une approche innovante de combinaison par fragments. Nous nous attendons à identifier plusieurs variants avec des profils pharmacologiques inédits.

Coordinateur du projet

Monsieur Vincent AUCAGNE (Centre National de la Recherche Scientifique-Centre de Biophysique Moléculaire)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS-CBM Centre National de la Recherche Scientifique-Centre de Biophysique Moléculaire
ICCF Institut de chimie de clermont-ferrand, UMR 6296
CEA CEA / DSV / Institut de Biologie et Technologies de Saclay (iBiTec-S)

Aide de l'ANR 498 230 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2015 - 42 Mois

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