Caractérisation structurale et fonctionnelle d’effecteurs de L. maculans et de leurs interactants – StructuraLEP

StructuraLEP est organisé en 3 tâches principales (plus un tâche 1 gestion du projet). La tâche 2 est consacrée à l’analyse structurale et fonctionnelle des effecteurs de L. maculans (production en système hétérologue, détermination de la structure tridimensionnelle, localisation in planta et processus cellulaires ciblés par les effecteurs). La production en système hétérologue des effecteurs est réalisée dans P. pastoris ou E. coli et suivie par la détermination de la structure 3D. La localisation sub-cellulaire des effecteurs est déterminée après expression transitoire dans le tabac des effecteurs couplés à un fluorochrome. Au moins deux effecteurs seront également localisés par immunocytolocalisation dans le colza pendant l’infection par L. maculans. Les processus cellulaires ciblés par les effecteurs seront identifiés en exprimant de façon stable des effecteurs de L maculans dans Arabidopsis thaliana et en analysant les phénotypes obtenus (sensibilité à une gamme d’agents pathogènes, modification de la morphologie ou de la physiologie de la plante). La tâche 3 est dédiée à la recherche de molécules et de protéines végétales interagissant avec les effecteurs, incluant des cribles haut-débit et des cribles avec a priori. La recherche de molécules interagissant avec les effecteurs est réalisée en utilisant un crible haut-débit avec des banques de ligands (incluant notamment des métaux et des co-facteurs). La recherche de protéines végétales cibles des effecteurs est réalisée par double-hybride dans la levure et par pull-down. Les candidats les plus interessants seront validées par des méthodes indépendantes comme la co-localisation, le BiFC ou le FRET-FLIM. La tâche 4 se focalisera sur la caractérisation structurale et fonctionnelle des interactions les plus pertinentes identifiées dans la tâche 3, via une co-cristallisation des partenaires de l’interaction et par manipulation des cibles végétales dans A. thaliana.

Tâche 2: Caractérisation structural et fonctionnelle des effecteurs de L. maculans
Des constructions ont été réalisées pour produire 5 de nos 6 effecteurs dans P. pastoris et / ou E. coli et ont permis la production de 3 des effecteurs. Deux Structures 3-D d’AvrLm4-7 ont été obtenues et la cristallogenèse est en cours pour 2 effecteurs. Des expériences d’expression transitoire dans des feuilles de tabac et d’A. thaliana ont permis de montrer une localisation nucléo-cytoplasmique pour 4 effecteurs et une localisation apoplastique pour 1 autre. 3 effecteurs ont été exprimés de façon stable avec ou sans peptide signal dans A. thaliana. Des expériences de suppression de mort cellulaire dans le tabac ont permis de trouver un effecteur qui supprime la mort cellulaire induite par BAX, NEP1 et AvrPto.
Tâche 3 : Recherche de molécules et de protéines végétales interagissant avec les effecteurs de L. maculans :
L’interaction d’AvrLm4-7 avec différents types de ligands (phosphoinositides, banque de ligands, acides nucléiques) a été testée, montrant une interaction d’AvrLm4-7 avec de l’ADN double-brin. Des cribles double-hybride dans la levure ont permis de déterminer des cibles végétales potentielles pour 4 effecteurs de L. maculans. Parmi ces cibles, on retrouve des protéines impliquées dans des voies de défense du colza, ce qui confirmerait le rôle des effecteurs dans la modulation de l’immunité de la plante hôte. Par ailleurs, nous avons pu valider par 3 méthodes (Double-hybride, BiFC et FRET-FLIM) que l’interaction entre protéines d’avirulence AvrLm10_1 et AvrLm10_2 était nécessaire pour leur reconnaissance par Rlm10. Une approche de pull-down visant également à identifier les protéines végétales interagissant avec les effecteurs de L. maculans est en cours de mise en place.

- Nous avons réussi à produire en système hétérologue puis à résoudre 2 structures d’AvrLm4-7 : l’une induisant la reconnaissance par la protéine de résistance Rlm7 et présentant une étiquette de fusion poly-histidine en C-terminal et une autre induisant une reconnaissance par Rlm4 et Rlm7 sans l’étiquette de fusion poly-histidine en C-terminal. La première structure a été intégrée un article (Blondeau, Blaise et al., 2015). Deux autres effecteurs ont pu être produits et purifiés, et leur cristallogenèse est en cours.
- L’interaction d’AvrLm4-7 avec différents ligands (phosphoinositides, banque de ligands, acides nucléiques) a été testée et a permis de voir une interaction entre AvrLm4-7 et des acides nucléiques double-brin. Ce travail a été intégré à l’article récemment publié décrivant la structure 3-D d’AvrLm4-7 et la caractérisation de la protéine (Blondeau, Blaise et al., 2015).
- AvrLm10-1 et AvrLm10-2 sont toutes deux nécessaires pour déclencher une reconnaissance par la protéine de résistance Rlm10. Nous avons pu montrer par 3 méthodes indépendantes (double-hybride, BiFC et FRET-FLIM) que ces deux protéines interagissent in vitro et in planta.
- Des cibles végétales ont été identifiées par double-hybride dans la levure pour 4 des effecteurs étudiés dans le projet. Ces cibles sont en cohérence avec une implication des effecteurs dans la modulation des réactions de défense de la plante hôte.

Blondeau K, Blaise F., Graille M., Kale S.D., Linglin J., Ollivier B., Labarde A., Lazar N., Daverdin G., Balesdent M.H., Choi D.H.Y., Tyler B., Rouxel T., van Tilbeurgh H. and Fudal I. (2015). The avirulence gene AvrLm4-7 of Leptosphaeria maculans: linking crystal structure to functional and adaptive characteristics. The Plant Journal. 83(4):610-624

Les champignons sont les principaux agents pathogènes de plantes, y compris des plantes ayant une grande importance économique, et ont un fort impact sur l’économie, la santé humaine et l’environnement. De plus, les champignons présentent une incroyable plasticité et une grande capacité de dissémination et d’adaptation à de nouveaux environnements, incluant des changements d’espèces végétales ou de méthodes de lutte. Leptosphaeria maculans est une parfaite illustration de ce phénomène. En effet, ce champignon ascomycète, responsable de l’une des principales maladies du colza, se comporte comme une espèce invasive et présente un très fort potentiel évolutif. Le contrôle des maladies fongiques nécessite une compréhension approfondie des déterminants de la pathogénie. Pendant l’infection, les agents phytopathogènes, notamment les champignons, sécrètent un arsenal de molécules, appelées effecteurs, éléments clés de la pathogénie qui modulent l’immunité innée de la plante et facilitent l’infection. Les effecteurs fongiques présentent une grande diversité et correspondent principalement à de petites proteines potentiellement sécrétées (PPS), n’ayant pas ou peu d’homologues dans les bases de données et pas de motifs connus. Par conséquent, leur fonction biologique est difficile à prédire et la résolution de leur structure tridimentionnelle peut être très informative pour déterminer cette fonction.
Sur ces bases, nous proposons un projet de recherche fondamentale, StructuraLEP, dont l’objectif est d’élucider l’implication d’effecteurs de L. maculans dans la pathogénie grâce à la détermination de leurs caractéristiques structurales et fonctionnelles et de leurs interactants. StructuraLEP est un projet interdisciplinaire qui implique deux équipes avec des expertises internationalement reconnues dans le domaine de la génomique fongique et de l’analyse fonctionnelle des effecteurs fongiques (Partenaire 1) et de la biologie structurale (Partenaire 2). Notre étude sera réalisée sur 6 effecteurs de L. maculans correspondant à des candidats prometteurs précédemment identifiés par le Partenaire 1 et choisis pour leur intérêt biologique (implication dans la fitness fongique, gène de résistance correspondant caractérisé, deux gènes AVR nécessaires pour être reconnus par un gène R, un gène AVR qui masque la reconnaissance d’un autre gène AVR par son gène R). Le projet StructuraLEP combine biologie structurale, génomique fonctionnelle, transformation de plantes et cytologie. Il est organisé en 3 tâches (plus une tâche de coordination) allant d’une tâche initiale visant à caractériser structuralement et fonctionnellement les effecteurs de L. maculans (Tâche 2), une tâche exploratoire impliquant le criblage de protéines végétales et de molécules pour leur interaction avec ces effecteurs (Tâche 3) jusqu’à une tâche focalisée sur la caractérisation physique et fonctionnelle des interactions identifiées (Tâche 4). Les effecteurs et leurs interactants seront analysés grâce à ces approches complémentaires pour répondre aux questions suivantes : (i) quelle est la structure 3-D des effecteurs de L. maculans ? (ii) Où agissent les effecteurs pendant l’infection d’une plante hôte ? (iii) Quelles molécules interagissent avec les effecteurs de L. maculans ? (iv) Quelles fonctions de la plante sont manipulées et quelles protéines végétales sont ciblées par ces effecteurs ? Intégrer des connaissances sur la structure 3-D des effecteurs, sur leur localisation et sur le ciblage de protéines végétales et de processus biologiques par ces effecteurs nous permettra de mieux comprendre les processus fondamentaux qui gouvernent l’association d’un champignon phytopathogène avec sa plante hôte. Ces connaissances pourront permettre de développer de nouvelles stratégies de contrôle des maladies fongiques au champ.