Centrosome, rôles physiologique et pathologique au cours du développement cortical – CREDO

Afin de déterminer les fonction de CEP41 au cours du développement, nous allons adopter deux approches complémentaires : 1) étant donné que le KO total pour CEP41 est létale, nous allons générer un modèle conditionnel (CEP41 lox) et le croiser avec des souris exprimant la CRE recombinase sour différents promoteurs afin d'invalider spécifiquement CEP41 dans différents types neuronaux; 2) nous allons utiliser la technique d'electroporation in utero (IUE) pour a) suivre en temps réel une cohorte de cellules dans des couches organotypiques de cerveaux (IUE des souris lox avec des vecteurs exprimant la CRE ou de souris sauvage avec des shRNA); b) évaluer l'effet des mutations de cep41; et c) de suivre la dynamique du centrosome en temps réel.
Afin d'étudier la composition protéique du centrosome dans le cerveau en développement, nous allons appliquer un protocole largement utilisé dans s'autres modèles cellulaires et isoler les centrosomes à partir de télencéphales de rat à E17,5, un stade caractérisé à la fois par de la migration et de la prolifération.

Nous avons analysé plus finement le profil d'expression de cep41 et montré une expression dynamique au cours du développement avec un pic d'expression qui coincide face le pic de neurone chez la souris. Nous avons généré des anticorps spécifiques et observé plusieurs localisations subcellulaires de CEP41 dans les cellules neuronales. Nous avons confirmé la localisation au centrosome, aux microtubules et au cil primaire. Dans le cortex, CEP41 est exprimé de façon uniforme de la zone ventriculaire jusqu'à la plaque corticale. Nous avons ensuite analysé la fonction de CEP41 dans les neurones glutamatergiques en développement. Nos premiers résultats montrent un défaut de positionnement des neurones invalidés pour CEP41, de nombreuses cellules étant «arrêtées« dans la zone intermédiaire. Ces résultats suggèrent un défaut de migration en l'absence de CEP41. Afin de déterminer si cette localisation anormale résulte d'un défaut dans les progéniteurs ou reflète plutôt un défaut de migration des neurones, nous avons invalidé cep41 spécifiquement dans les neurones post-mitotiques. Pour cela, nous avons généré des constructions qui permettent l'expression conditionnelle du shRNA dirigé contre cep41 dans cellules exprimant la CRE recombinase. Ces constructions ont été électroporées dans les souris Nex-CRE qui expriment la CRE uniquement dans les neurones post-mitotiques. Nos premiers résultats suggèrent un effet de dose. En effet, alors qu'une forte diminution de l'expression de cep41 (80%) induit un phénotype de migration, une réduction de 40% n'a pas d'effet sur la migration.
Pour notre second axe de travail, nous avons mis et point et optimisé le protocole de purification des centrosomes à partir de cerveaux d'embryons de rats. Nous sommes en train d'augmenter l'échelle de purification afin d'avoir assez de matériel pour nos futures analyses protéomiques.

Nos premiers résultats sont très encourageants et nous poussent à poursuivre notre étude de la fonction de CEP41 au cours de la corticogènése. Pour la prochaine période, nous souhaitons 1/ déterminer les mécanismes moléculaires par lesquels CEP4 regule la migration neuronale ; 2/ étudier si CEP41 est également requis pour la migration tangentielle des interneurones et 3/ analyser la fonction de CEP41 dans les progéniteurs corticaux.

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Le cortex cérébral constitue la partie dorsale du télencéphale. Il présente une organisation en couches et est divisé en aires distinctes, impliquées dans des fonctions spécifiques (motrice, sensorielle ou cognitive). Une coordination très fine entre la génération spatio-temporelle de différents types cellulaires et le contrôle de leur migration ainsi que de leur localisation finale est à la base de la construction d'une structure aussi complexe. Le cortex cérébral est composé de deux classes de neurones: les neurones de projection dits «excitateurs», et les interneurones dits «inhibiteurs». Les neurones de projection naissent dans la zone ventriculaire du télencéphale dorsal et migrent de façon radiaire pour atteindre la plaque corticale. Les interneurones sont générés dans les éminences ganglionnaires et migrent de façon tangentielle avant de s’intégrer dans la plaque corticale. Un nombre croissant de données soutient l'idée que de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques –allant de l'épilepsie au retard mental– ont pour origine une altération de processus du développement du cortex cérébral.
Le centrosome est le centre organisateur des microtubules dans les cellules animales. Cette organelle cellulaire unique joue un rôle prépondérant dans de nombreux processus cellulaires, tels que la division, la migration et la prolifération. De façon intéressante, un dysfonctionnement du centrosome est impliqué dans plusieurs maladies neurodéveloppementales. Ces pathologies sont associées aussi bien à des défauts de prolifération, de migration et de différentiation neuronale, suggérant un rôle du centrosome au cours de ces différentes étapes du développement neuronal. Par ailleurs, de plus en plus d’éléments révèlent une plus grande sensibilité du cerveau aux anomalies centrosomales. Pourquoi le cerveau en développement est-il plus affecté par des dysfonctions de protéines centrosomales? Existe-t-il une composition protéique du centrosome spécifique aux neurones? Quelle serait l'importance physiologique de cette signature? Dans quelle mesure une modification de cette signature corticale contribuerait aux pathologies neurodéveloppementales? Répondre à ces questions est essentiel pour interpréter les mécanismes pathologiques qui participent à l'apparition et à la progression de troubles neurologiques. En dépit de l'identification de centaines de protéines centrosomales, les mécanismes par lesquels cet organite coordonne les étapes du développement cortical restent en grande partie inconnus. Le principal objectif de cette étude est de mieux caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels le centrosome contrôle la corticogenèse à la fois en condition physiologique et pathologique.
Nous allons tout d’abord adopter une approche par candidat et caractériser en détail les fonctions de CEP41, une protéine centrosomale mutée dans plusieurs troubles du développement cortical. Nous proposons d'évaluer, dans des modèles murins et humains, les fonctions de CEP41 et de ses variants au cours des différentes étapes de la neurogénese corticale: i) prolifération; ii) spécification et iii) migration. Afin d’élucider les mécanismes moléculaires mis en jeu nous proposons en outre un criblage à haut débit des partenaires moléculaires de CEP41. Deuxièmement, nous allons adopter une approche globale consacrée à la caractérisation du protéome du centrosome dans le cortex en développement. Nous allons, d’une part, réaliser une analyse protéomique du centrosome isolé à partir de cerveaux embryonnaires et ensuite identifier et valider de nouvelles protéines centrosomales spécifiques des neurones.
L’identification de nouveaux composants du centrosome spécifiques du cortex ne devrait pas uniquement fournir des indices sur les voies moléculaires impliquées dans le développement cortical, mais pourrait également révéler des nouveaux mécanismes cellulaires dépendants du centrosome et importants pour le développement du cortex cérébral.