Relation structure-fonction d'une famille d'histidine kinases contrôlant le mode de vie de Pseudomonas aeruginosa – REGALAD

Ce projet sera réalisé en utilisant une combinaison d’approches multidisciplinaires incluant la génétique, la microbiologie, la biochimie, la biophysique et biologie structurale issues de plateformes technologiques . Les deux partenaires documenteront les aspects moléculaires et structuraux de ces HK et le partenaire 2 apportera son expertise complémentaire sur la biologie des TCS chez Pseudomonas.

Nous avons obtenu des résultats complémentaires sur la fonction et la structure de cette famille de kinase hybrides propres à Pseudomonas avec i) la détermination du rôle fonctionnel du domaine senseur périplasmique de l'HK central GacS, ii) la structure en solution de ce domaine, iii) l'identification par mutagenèse dirigée de résidus clés de ce domaine périplasmique et dans le domaine de dimérisation cytoplasmique H1 de RetS pour la fonction de ces HKs et iv) la cristallisation du domaine cytoplasmique H1 de RetS

L'ensemble de ces travaux apporteront des informations essentielles sur les mécanismes moléculaires responsables de l'activité antagoniste de cette voie de signalisation impliquant cette famille de TCS/HK, unique à Pseudomonas, ainsi que des connaissances importantes sur ce commutateur moléculaire gouvernant la pathogénicité de cette bactérie pathogène. Ces travaux pourront contribuer au développement de stratégies thérapeutiques.

Charbonnier et al. (2016) PLoS Genet 12:e1006032

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste et s’est révélé être l’organisme pathogène opportuniste le plus néfaste pour l’homme puisqu’elle est à l’origine du taux de mortalité élevé et précoce chez les patients atteints de la mucoviscidose et le développement de nombreuses infections nosocomiales. PA est capable de moduler son mode de vie par la formation d’une communauté bactérienne persistante organisée en biofilm ou planctonique. Parmi les mécanismes de régulation impliqués dans ce processus, le système de régulation à deux composants (TCSs) GacS/GacA joue un rôle central et critique dans le contrôle de ce mode de vie et son action est modulé de manière antagoniste par les trois kinases hybrides (HK) LadS, RetS et PA1611 qui sont uniques au genre Pseudomonas. Ces TCS possèdent une organisation classique qui associe une histidine kinase membranaire qui reconnaît un signal environnemental par son domaine détecteur périplasmique et un domaine transmetteur cytoplasmique qui s’autophosphoryle pour activer un autre partenaire appelé régulateur de réponse. La structure tridimensionnelle du domaine de détection périplasmique de RetS a montré un repliement de type sandwich beta homologue à celui des domaines reconnaissant les glycanes (CBM), comme aussi proposé pour le LadS. En revanche, les domaines de détection plus petits de GacS et PA1611 montrent une homologie avec le repliement de type profiline/PDC qui a été identifié dans le domaine de détection de la kinase hybride DcuS du TCS DcuS/DcuR chez E. coli. Comme la plupart des TCS, l’HK GacS fonctionne sous forme dimérique via l’association du domaine transmetteur cytoplasmique H1 qui est composé de deux sous domaines, un module Dhp (dimerisation et histidine phosphotransfer) contenant un résidu His conservé et un module kinase fixant l’ATP. Cependant, le mécanisme par lequel les domaines périplasmiques et cytoplasmiques de ces TCS transfert le signal et déclenche la réponse cellulaire à travers l’assemblage et le désassemblage de différentes formes oligomeriques demeure pas clair. Il reste donc à identifier les bases moléculaires dans le domaine transmetteur H1 de ces quatre GacS/PA1611/LadS/RetS HK qui dictent la formation d’homodimères versus les hétérodimères et pourquoi l’HK LadS se comporte différemment en ne formant que des homodimères. Ce projet adressera ces obstacles en réalisant la caractérisation structurale de ce système de régulation à protéines multiples impliquant GacS-PA1611-RetS-LadS. Nous allons élucider i) les déterminants fonctionnels des domaines de détection et évaluer si ces HK possèdent un véritable site de fixation et ii) les bases moléculaires de la spécificité de dimérisation en focalisant sur les domaines transmetteurs cytoplasmiques pour identifier s’ils forment préférentiellement des homo ou hétérodimères. Le programme de travail est organisé en deux taches principales impliquant une collaboration étroite entre deux partenaires et sera réalisé en utilisant une combinaison d’approches multidisciplinaires incluant la génétique, la microbiologie, la biochimie, la biophysique et biologie structurale issues de plateformes technologiques . Les deux partenaires documenteront les aspects moléculaires et structuraux de ces HK et le partenaire 2 apportera son expertise complémentaire sur la biologie des TCS chez Pseudomonas. Ces travaux apporteront des informations essentielles sur les mécanismes moléculaires responsables de l'activité antagoniste de cette voie de signalisation impliquant cette famille de TCS/HK, unique à Pseudomonas, ainsi que des connaissances importantes sur ce commutateur moléculaire gouvernant la pathogénicité de cette bactérie pathogène. L’ensemble de ces travaux pourra contribuer au développement de stratégies thérapeutiques.