Interactions cellules / matrice extracellulaire: application à la réparation de la peau – SKINHEALING

Dans un premier temps, les propriétés du peptide seront optimisées en accord avec les contraintes rencontrées in vivo et avec une utilisation en clinique humaine (production selon les bonnes pratiques de laboratoire, stérilisation, évaluation de la stabilité après stérilisation et au cours du temps, évaluation et optimisation de la stabilité dans des situations protéolytiques comme dans les fluides des plaies aigues ou chroniques, évaluation de la biocompatibilité et de la tolérance et études toxicologiques selon les normes pharmaceutiques. Dans un second temps, des formes pharmaceutiques seront développées selon la type de plaies et leur sévérité. Une forme galénique simple sera développée pour les plaies aigues sans complications et une formulation ou un biomatériau contenant le peptide sera adapté aux plaies plus complexes. La preuve de concept in vivo de l’effet cicatrisant du peptide sera effectuée dans des modèles de plaie aigue superficielle et semi-profonde chez le porc. Le choix de ce modèle repose sur les nombreuses similarités entre la peau du porc et celle de l’homme, notamment le processus de cicatrisation qui résulte de la formation d’un tissu de granulation soumis à un processus de contraction. Des études précliniques additionnelles seront menées pour évaluer l’effet du peptide dans les plaies complexes. Le modèle de rat sera utilisé pour effectuer des plaies larges mimant les brûlures de 3eme degré, et un modèle de rat diabétique permettra d’obtenir des plaies chroniques. De la recherche fondamentale sera menée en parallèle pour tenter d’appréhender le mécanisme d’action du peptide au niveau des kératinocytes. Pour cela, un modèle tridimensionnel de ré-épithélialisation in vitro sera développé.

Les travaux menés au cours des 18 premiers mois ont permis de définir les conditions cGMP de production du peptide initial et d’identifier la méthode de stérilisation compatible avec le maintien de son activité. Nous avons également défini son dégradome au cours du temps après incubation avec des protéases caractéristiques de l’environnement d’une plaie. L’analyse nano-LC/MSMS à permis de mettre en évidence l’activité exopeptidique du sérum et endopeptidique de l’élastase (NE) et de l’auréolysine (AL). Un panel de modifications chimiques a été appliqué sur la séquence peptidique initiale (protection N-terminale, différentes approches de cyclisation, modifications de certains acides aminés, N-méthylation, réduction de taille..) en vue d’améliorer sa résistance aux protéases et sa stabilité in vivo. L’activité biologique des peptides modifiés a été évaluée par des tests d’adhésion cellulaire syndécan-1 dépendante et les peptides bioactifs ont été soumis aux tests de digestion protéolytique. Si la résistance aux dégradations protéolytiques (par les enzymes du sérum, la NE et l’AL) a été augmentée dans tous les cas, deux peptides ont présentés une résistance intéressante puisque leur séquence restait de 80 à 100% intacte après 20 heures d’incubation. Des tests de migration cellulaire (vidéo-microcopie time Laps et tests de blessure) ont révélé leur activité pro-migratoire sur les kératinocytes de l’épiderme. Différentes formes pharmaceutiques (gel et compresses) incluant les peptides d’intérêt ont été produites en vue de l’évaluation de leur efficacité dans un modèle porcin de plaies in vivo. Les essais préliminaires effectués dans ce modèle ont permis de définir la taille et la profondeur des plaies compatibles avec ces études. Dans le même temps et pour étudier la dynamique du syndécan-1 au cours de la migration des kératinocytes, un syndécan-1 couplé à la Green Fluorescent Protein a été produit. Ce dernier s’est révélé être fonctionnel.

L’ensemble des perspectives s’inscrivent dans la continuité des travaux effectués. L’évaluation de l’efficacité in vivo des peptides modifiés sera l’une de nos priorités. Le modèle de plaie chez le porc sera utilisé pour évaluer l’activité des deux peptides modifiés d’intérêt et identifier la forme galénique compatible avec son activité et avec une utilisation sur les plaies aigues. La dose optimale de peptide devra être déterminée en fonction de son activité et de sa cinétique de relargage à partir de la compresse ou du gel. Deux modèle de plaies chroniques seront ensuite développés chez le rat ; un modèle de plaie large mimant des brûlures au 3ème degré et un modèle de plaie chronique chez le rat diabétique. Des formes galéniques adaptées à ce type de plaies seront développées afin de prendre en compte la composante dermique. Dans tous les cas, la vitesse d’épithélialisation et la qualité du processus de cicatrisation globales seront évalués. Des études de tolérance et toxicologie réglementaire seront démarrées dès que le choix du peptide d’intérêt sera arrêté. Des travaux de recherche fondamental seront poursuivis dans le but (1) de comprendre le mécanisme d’action du domaine de laminine concerné et du peptide et (2) développer des modèles d’étude de la régénération épidermique fiables et compatibles avec le criblage de molécules. Le rôle du syndécan-1 dans la migration des kératinocytes sera appréhendé sur des cultures 2D de kératinocytes et à l’aide des modèles 3D en cours de développement. Ainsi, nous évaluerons la dynamique du syndécan-1-GFP sur cellules vivantes par vidéo microscopie et microscopie confocale.

Peptide promoting cell adhesion and migration.
Applicants : Symatese; Univ Claude Bernard Lyon; CNRS.
European patent, PCT/EP2009/067597 filed Dec. 18, 2009 - WO2009EP67597
United State Patent, US 2012/0114617, filed on May 10, 2012.
Japon patent, 2011-553501, filed on November 26, 2014 ; issued on September 2, 2015

Michopoulou A. and Rousselle P. How do epidermal matrix metalloproteinases support re-epithelialization during skin healing? Eur J Dermatol. 2015 Apr;25 Suppl 1:33-42.

Senyürek I, Kempf WE, Klein G, Maurer A, Kalbacher H, Schäfer L, Wanke I, Christ C, Stevanovic S, Schaller M, Rousselle P, Garbe C, Biedermann T, Schittek B (2014) Processing of Laminin a Chains Generates Peptides Involved in Wound Healing and Host Defense. J Innate Immun 2014, 6:467-84.

Rousselle P, Michopoulou A and Delso Costa C. Rôle du microenvironnement cellulaire dans la cicatrisation cutanée. Biologie Cutanée, CoBiP 2013. pp 210-229, Eds MatriX 2014.

Rousselle P, Carulli S, Chajra H, Dayan G, Pin D and Herbage B (2013) The syndecan binding sequence KKLRIKSKEK in laminin a3 LG4 domain promotes epidermal repair. Eur J Dermatol 23:57-65.

Cinq millions de personnes ont besoin annuellement de pansements cicatrisants pour le traitement des plaies (brûlures aigues ou superficielles, brûlures, escarres et ulcères de jambes diabétiques). Bien que de nombreux pansements destinés à favoriser la cicatrisation cutanée soient actuellement sur le marché, de nombreux problèmes subsistent dans la prise en charge des cas de cicatrisation les plus compliqués pour lesquels le rôle de barrière de la peau contre les infections n’est plus assuré. En effet, le problème de la cicatrisation des plaies chroniques va en s’accroissant du fait de l’allongement de la durée de la vie des patients fragiles, du vieillissement des populations et de l’accroissement de la population diabètique. Des avancées majeures ont été apportées par la mise au point de pansements d’origine biologique (alginate, collagène..) qui interagissent avec le tissu lésé et apportent un environnement favorable à la formation du tissu de granulation dermique. La ré-épithélialisation de la plaie commence dès l’initiation de la cicatrisation et joue un rôle déterminant dans l’efficacité globale du processus et il est surprenant qu’aucune thérapie destinée à déclencher/favoriser cette étape ne soit disponible sur le marché. La mise au point de pansements porteurs de bio-molécules (facteurs de croissance, peptides mimétiques) destinées à être délivrées localement pour favoriser la réparation de l’épiderme annonce la prochaine génération de pansements et dispositifs destinés à la prise en charge des plaies. L’épithélialisation des plaies se déroule selon un enchaînement de séquences ordonnées au cours desquels les kératinocytes migrent, prolifèrent et se différencient pour restaurer la fonction barrière de la peau. Les interactions cellules / microenvironnement matriciel jouent un rôle important dans le contrôle de l’adhésion et de la migration des kératinocytes par le biais de la formation de structures d’adhésion qui permettent à un dialogue moléculaire de se mettre en place pour informer et diriger la cellule.
L’objectif du projet SKINHEALING est de développer un décapeptide innovant dont la séquence est issue d’une protéine de la matrice extracellulaire appelée laminine 332, connue pour être impliquée dans l’adhésion et la migration des kératinocytes de l ‘épiderme. Les propriétés biologiques du peptide ont été caractérisées in vitro et l’évaluation préliminaire de l’efficacité du peptide in vivo, mesurée dans un modèle de plaie superficielle chez le porc, a montré une réduction significative du temps de fermeture des plaies par l’accélération de la phase de ré-épithélialisation. La technologie a été brevetée dans le cadre d’un partenariat du CNRS avec l’entreprise pharmaceutique Symatèse, spécialisée dans les biotechnologies appliquées à la réparation et régénération tissulaires.
L’objectif du projet SKINHEALING est maintenant d’optimiser ce peptide pour une utilisation en clinique humaine dans le but de favoriser ou déclencher la cicatrisation cutanée dans divers types de plaies. Nos priorités seront (1) le développement de modèles animaux de plaies aigues et chroniques validés pour évaluer l’efficacité du peptide, (2) le développement industriel du peptide comprenant entre autres, l’optimisation de sa stabilité in vivo et sa résistance à la protéolyse ainsi que le développement de formulations adaptées et (3) l’étude de son mécanisme d’action. Le projet SKINHEALING rassemble 3 partenaires présentant des expertises complémentaires, P. Rousselle (partenaire 1, coordinateur, CNRS, Lyon) chercheur et biologiste cellulaire, B. Herbage (partenaire 2, Symatèse, Chaponost), spécialiste du développement pharmaceutique dans le domaine de la réparation tissulaire, et D. Pin (partenaire 3, Ecole Vétérinaire de Lyon) dermato-vétérinaire spécialiste des modèles de plaies chez l’animal. De plus, le projet bénéficiera de la participation de F. Braye, chirurgien plasticien, chef du service des Grand Brûlés à Lyon.