Rôle du c-di-GMP dans le contrôle via des « riboswitch » et des ARN antisens de processus cellulaires associés au comportement communautaire chez Clostridium difficile, une bactérie opportuniste responsable d’infections nosocomiales – CloSTARn

Par les approches globales et ciblées nous étudions le rôle de ARN régulateurs associés au c-di-GMP dans le contrôle de cycle infectieux de C. difficile.
En particulier, nous utilisons les approches globales d’analyse de transcriptome (puces à ADN et séquençage à haut debit) pour avoir une vue d’ensemble des effets de c-di-GMP chez ce pathogène, ainsi que pour identifier la fonction des gènes ciblés par cette régulation en analysant les souches inactivées pour les gènes correspondants. Ces approches globales sont complétées par l’analyse de l'expression des gènes sélectionnés et l’étude phénotypique pour démontrer leur rôle dans la mise en place de comportement communautaire chez C. difficile.
Pour aborder les mécanismes moléculaires en jeu dans les processus de régulation en réponse au c-di-GMP, nous étudions les effets de délétion et de surexpression des ARN régulateurs spécifiques sur l’expression des gènes cibles et les phénotypes associés incluant la sensibilité aux bactériophages et la formation de biofilms. Nous avons utilisé avec succès une nouvelle approche de délétion chromosomique chez C. difficile ainsi qu’un système de l’expression inductible. Pour analyser les interactions de C. difficile avec les bactériophages nous avons utilisé une approche de séquençage à haut débit pour identifier les séquences des génomes de 10 nouveaux bactériophages isolés par nos collaborateurs au Canada.

Nous avons réalisé une analyse transcriptomique des effets de c-di-GMP chez C. difficile qui montre le rôle global de cette molécule de signalisation et nous permets d’identifier ses cibles. Nous avons progressé dans la caractérisation fonctionnelle des cibles de régulation par les « riboswitch » dépendant de c-di-GMP. Nous avons utilisé une nouvelle approche de délétion chromosomique chez C. difficile pour construire des souches mutantes pour les « riboswitch » associés aux ARN antisens. Cela va nous permettre d’avancer plus loin dans la compréhension des mécanismes associés. De plus, nous avons inactivé les gènes codant les deux régulateurs potentiellement impliqués dans le contrôle de comportement communautaire chez C. difficile. Par les approches globales et ciblées nous étudions leur rôle dans le contrôle de cycle infectieux de C. difficile.
Nous avons accomplie la caractérisation détaillée du fonctionnement du système CRISPR-Cas de défense contre l’ADN étranger chez C. difficile et avons démontré l’expression active des ARN CRISPR. Grâce au séquençage des génomes phagiques et l'analyse de spectre d'hôtes de plusieurs nouveaux phages de C. difficile ainsi que les expériences de conjugaison de plasmides nous apportons pour la première fois la preuve de la fonction défensive du système CRISPR-Cas chez C. difficile. Ces données ouvrent la voie à des analyses mécanistiques et physiologiques des interactions d’un pathogène important humain avec ses parasites génétiques via système CRISPR-Cas. Les résultats de ce travail collaboratif incluant 4 laboratoires en France, au Canada, aux Etats-Unis et en Russie sont en cours d’évaluation pour publication dans mBio. L’étudiant en thèse participant au projet a pu bénéficié d’un stage d’été dans le cadre du programme de mobilité internationale des doctorants en 2015 sur l’étude du système CRISPR-Cas de C. difficile chez un hôte hétérologue E. coli dans un laboratoire de Severinov aux Etats-Unis (Rutgers University).

La réalisation du projet CloSTARn permettra de mieux comprendre le rôle des nouveaux mécanismes basés sur l’action des ARN dans le réseau de régulation contrôlant des processus indispensables pour le développement de C. difficile chez l’hôte.
Comme une perspective à long terme nos données peuvent être utilisées pour le développement d'inhibiteurs spécifiques de voie c-di-GMP, des méthodes pour empêcher le fonctionnement normale du système de défense CRISPR ou la formation des biofilms par C. difficile dans les communautés de l'intestin et de l’approche de « phage thérapie » pour limiter le développement de C. difficile.

La validation d’une nouvelle puce à l’ADN incluant les ARN régulateurs que nous avons identifiés récemment fait partie d’une publication Boudry et al. 2014 dans J. of Bacteriology.
Un article décrivant l’utilisation de séquençage à haut débit pour l’identification des « riboswitch » est publié dans Methods in Enzymology en 2014.
Le travail collaboratif visant la caractérisation fonctionnelle du système CRISPR de défense contre l’ADN étranger est en cours d’évaluation pour publication dans mBio.

Clostridium difficile est la principale cause de diarrhées nosocomiales chez les adultes dans les pays industrialisés. Les facteurs de risque sont l’âge et l’antibiothérapie qui par son action sur la flore intestinale facilite l’émergence de C. difficile dans le tube digestif. La proportion de formes sévères d’infections à C. difficile augmente actuellement de manière très préoccupante en Europe. Les processus de colonisation du tube digestif et les fonctions associées ainsi que les mécanismes qui contrôlent le cycle infectieux sont encore peu étudiés. Mieux comprendre la régulation de ces processus semble indispensable pour l’étude de ce pathogène émergent humain.
Nos données récentes de séquençage à haut débit (RNA-seq) ont montré l’existence d’un grand nombre d’ARN régulateurs potentiels présent chez C. difficile ce qui suggère l’importance des mécanismes de régulation de l’expression des gènes basés sur l’action des ARN chez cette bactérie. Nous avons mis en évidence des ARNs agissant en cis incluant 66 systèmes de contrôle par terminaison précoce de la transcription ou par modulation de l’initiation de la traduction de type « riboswitch ». Parmi eux, 16 correspondent à des « riboswitch » fonctionnels reconnaissant la présence du cyclic-di-guanosyl-5’monophosphate (c-di-GMP), un signal clé chez les protéobactéries intervenant lors de la transition entre le mode de vie planctonique et la vie communautaire. Le c-di-GMP est impliqué dans la répression de la motilité, l’induction de la formation des biofilms et la modulation de la virulence chez les bactéries pathogènes. Le rôle du c-di-GMP est mal connu chez les bactéries à Gram-positif. Cependant, des publications récentes et nos résultats préliminaires suggèrent un rôle crucial du c-di-GMP pour C. difficile.
Dans le présent projet nous analyserons le rôle du c-di-GMP dans le fonctionnement des « riboswitch », l’expression des gènes contrôlés et les phénotypes associés incluant la motilité, la formation des biofilms, l’adhésion et la résistance à l’infection phagique. La présence chez C. difficile d’effecteurs ARN de type « riboswitch » en réponse au c-di-GMP et la localisation de trois de ces « riboswitch » en antisens pour les gènes régulés sont tout à fait originales. Nous analyserons plus en détails les gènes induits par l’action de « riboswitch » en présence de concentration élevée de c-di-GMP, qui constituent des bons candidats pour les facteurs associés au comportement communautaire chez C. difficile. Cela inclut deux régulateurs et deux protéines de surface potentiellement impliqués dans la formation de biofilm. Nous allons aussi nous focaliser sur deux « riboswitch » dépendant de c-di-GMP qui de façon très originale sont associés à des ARN antisens et peuvent contrôler un régulateur transcriptionnel et un système CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) de défense contre l’ADN étranger. Par les approches globales et ciblées nous étudierons le rôle de ces ARN régulateurs dans le contrôle de cycle infectieux de C. difficile. Un aspect particulièrement intéressant de présent projet concerne le lien possible entre le c-di-GMP et la régulation de système CRISPR. L’induction de système CRISPR en présence de c-di-GMP par intermédiaire de l’ARN antisens associé au « riboswitch » pourra conduire à l’augmentation de capacités de défense de C. difficile au sein de communautés bactériennes dans le tube digestif riches en bacteriophages. La réalisation du projet CloSTARn permettra de mieux comprendre le rôle des nouveaux mécanismes basés sur l’action des ARN dans le réseau de régulation contrôlant des processus indispensables pour le développement de C. difficile chez l’hôte.