Les ARN hélicases à boite DEAD: quels sont leurs rôles, leurs partenaires, leurs substrats ARN et comment elles fonctionnent. – HeliDEAD

Le projet HeliDEAD est divisé en 8 parties: (1) molécule unique/pinces magnétiques, (2) analyses génétiques chez la levure, (3) identification des partenaires protéiques, (4) intéractions avec les co-facteurs protéiques, (5) caractérisation enzymatique, (6) identification des substrats ARN, (7) analyses des extraits cellulaires de levure, (8) localisation cellulaire des protéines. Dans la première tâche, le partenaire 2 (groupe de V. Croquette) et le partenaire 1 (groupe de K. Tanner) utilisent les pinces moléculaires en molécule unique pour analyser le mécanisme moléculaire des hélicases à ARN. Un ADN formant une longue tige-boucle est attaché à une lame de verre d’un coté et à une bille magnétique de l’autre. Ce double brin peut-être déroulé quand on applique une force magnétique. On peut bloquer sa fermeture en ajoutant un petit ARN complémentaire. Si on ajoute alors une hélicase à ARN et de l’ATP, on peut suivre la vitesse de reformation du double brin dans différentes conditions expérimentales. Ces expériences permettent d’apporter une meilleure compréhension du mécanisme moléculaire mis en jeu dans ces réactions.
Les tâches 2-7 sont toutes liées. Pour rechercher les partenaires des hélicases à ARN le partenaire 1 réalisera des expériences de pull-down à partir d’extraits de levure, des analyses protéiques par spectrométrie de masse et par western blots. Pour rechercher s’il existe une relation fonctionnelle entre les hélicases et les protéines précédemment identifiées, le partenaire 1 pourra réaliser des expériences de génétique de la levure. Enfin, les partenaires protéiques pourront être purifiés à partir de E.coli, afin de tester leur effet sur l’activité de l’hélicase.
La mission 8 est réalisée en collaboration avec les partenaires 1 et 3 (N. Belgareh-Touzé). Ils utiliseront des protéines fluorescentes pour regarder la localisation cellulaire des hélicases et de leurs partenaires dans certaines conditions de culture.

Nous avons récemment publié un article portant sur les tâches 2-5 et 8, en collaboration avec le partenaire 3 (Senissar et al, 2014, Nucleic Acids Res. 42, 10005–10022). Nous avons trouvé que l’hélicase Ded1 faisait partie d’un complexe qui se forme en s’associant avec la 7-methyl guanosine en 5’ des ARN messagers cappés, et qu’elle se trouvait dans le noyau et dans le cytoplasme. Nous avons déterminé quels étaient les partenaires de Ded1 par des expériences de pull-down, de spectrométrie de masse ou de western blot. Nous avons cloné les gènes codant pour ses partenaires, les avons exprimés dans E. coli; puis nous avons purifié les protéines et regardé si Ded1 interagissait directement avec ces partenaires. Enfin, nous avons montré que Ded1, étiquetée GFP pouvait faire la navette entre le noyau et le cytoplasme. Pour ceci, nous avons utilisé des souches de levure déficientes dans le transport, soit déficiente dans la voie Mex67 soit dans la voie de l’exportin (impliquant Crm1). Pour résumer nos résultats, nous avons montré que Ded1 interagissait physiquement et génétiquement avec eIF4E, Pab1 et eIF4G dans le cytoplasme, et avec Cbp20, Cbp80 et Nab2 dans le noyau. De plus, nous avons pu montrer que l’activité enzymatique de Ded1 était en partie stimulée par la présence de ces partenaires. Ces résultats sont en accord avec ceux publiés par d’autres groupes pour DDX3, l’équivalent humain de Ded1 qui joue un rôle dans la réplication virale et dans l’oncogénèse.
Ce travail se poursuit et nous avons déjà trouvé d’autres partenaires que nous analysons. Nous avons également obtenu un mutant de Ded1 qui fixe l’ARN et l’ATP avec une haute affinité, mais qui est incapble d’hydrolyser l’ATP ou de recycler les complexes. Cette protéine mutante, selon les conditions choisies, est capable de s’accumuler dans des granules cytoplasmiques constituées d’ARN et de protéines, appelés “P-bodies”.

Les hélicases à ARN, tout particulièrement les protéines à boite DEAD, jouent un rôle essentiel dans l’expression génétique chez tous les organismes, de la bactérie aux systèmes multicellulaires plus complexes. Ces protéines sont des moteurs moléculaires dépendant de l’ATP, qui permettent une régulation fine et spécifique de tous les processus cellulaires impliquant l’ARN telles que la transcription, l’épissage, la traduction ou la dégradation. Il y a 45 hélicases à ARN chez la levure, dont 25 à boite DEAD. Ces protéines sont très souvent essentielles et rarement interchangeables. La levure représente un système modèle d’étude très utile, car on peut facilement déléter ou introduire des mutations dans un gène, et regarder les phénotypes obtenus. L’analyse enzymatique de ces protéines purifiées à partir de E. coli peut compléter l’analyse génétique. On peut étudier les liens génétiques et biochimiques existant entre l’hélicase et ses partenaires protéiques. Ainsi, la levure représente un modèle simplifié d’étude des hélicases de plantes ou de métazoaires. Son génome ne contenant en général qu’une seule copie des gènes, l’analyse génétique est beaucoup plus facile. Enfin, les protéines de levure ont souvent moins de modifications post-traductionnelles comparées aux protéines des métazoaires, et par conséquent elles sont plus faciles à purifier et à étudier in vitro. Du fait de la forte conservation fonctionnelle entre les espèces, on peut ainsi utiliser les protéines de la levure comme modèles.
Ainsi, nous espérons pouvoir modifier et controler les hélicases in vivo. On peut par exemple utiliser l’hippuristanol, un inhibiteur allostéric de l’hélicase eIF4A, qui est très fortement exprimée lors de l’oncogénèse. Nous avons également trouvé des composés capables d’inhiber des ARN hélicases à boite DEAD de Leishmania, un protazoaire très infectueux. D’autres recherches sont en cours pour trouver des inhibiteurs de certaines hélicases du pathogène Candida albicans.

Senissar, M., Saux, A. L., Belgareh-Touzé, N., Adam, C., Banroques, J., & Tanner, N. K. (2014). The DEAD-box helicase Ded1 from yeast is an mRNP cap-associated protein that shuttles between the cytoplasm and nucleus. Nucleic Acids Res., 42, 10005–10022. doi:10.1093/nar/gku584
Saurabh, R., Bagchi, D., Fiorini, F., Le Hir, H., Tanner, K., Banroques, J., & Croquette, V. (2014) «RNA Helicases on the Move.« Biophys. J., 106, 71a–72a.
Banroques, J. & Tanner, N. K. (2015) Methods to study the structural and functional elements of DEAD-box RNA helicases. Methods Mol. Biol. 1259, 199-209.
Bizebard, T., & Dreyfus, M. (2015) A FRET-based, continuous assay for the helicase activity of DEAD-box proteins. Methods Mol. Biol. 1259, 165-181.

La famille des hélicases à ARN à boite DEAD sont des protéines ubiquitaires présentent dans tous les règnes du vivant et qui sont associées à tous les processus cellulaires impliquant l’ARN, de la transcription à la dégradation de l’ARN. Ces protéines, impliquées dans des processus cellulaires très spécifiques, sont très souvent essentielles, rarement interchangeables, et elles peuvent être impliquées dans certaines pathologies. Cependant, les protéines purifiées ne montrent que peu ou pas de spécificité de substrat in vitro. Elles ont besoin à la fois de l’ATP pour lier leur substrat ARN, et de l’ARN pour hydrolyser l’ATP. De nombreuses hélicases sont capables de dissocier les duplex d’ARN in vitro, mais elles sont très peu efficaces. Elles sont aussi capables de remodeler des structures secondaires et tertiaires, et d’assembler ou de modifier des complexes ribonucléoprotéiques. Mais, très peu de choses sont connues quant aux mécanismes d’action de ces protéines et en général, on ne connait pas leur vrai substrat. Ce sont certainement leurs partenaires qui leurs apportent la spécificité et qui permettent la régulation des processus physiologiques au sein de la cellule. Nous avons donc pour objectifs de:
- identifier les partenaires
- identifier les authentiques substrats ARN
- reconstituer le(s) complexe(s) nucléoprotéique(s) in vitro
- élucider leur(s) rôle(s)
- utiliser des approches de type “molécule unique” pour disséquer et comprendre les mécanismes moléculaires utilisés par ces protéines.

La protéine de levure Ded1 a été choisie comme hélicase modèle pour réaliser ce projet, car c’est une protéine essentielle in vivo qui possède de très bonnes activités enzymatiques in vitro. Ainsi, nous avons pu développer pour la première fois un essai pour mesurer les effets des hélicases à boite DEAD sur le déroulement des duplex d’ARN, en utilisant des pinces magnétiques en molécule unique. Cet essai, développé par Vincent Croquette, nous permettra de mesurer les vitesses de déplacement d’un oligonucléotide ARN, les constantes d’affinité et de regarder les effets des cofacteurs. Nous pouvons également purifier les complexes associés à Ded1, et analyser leur composition protéique par immunodétection et par spectrométrie de masse. Ceci nous a déjà permis d’identifier plusieurs complexes et certains des partenaires de Ded1. Nous pourrons reconstituer ces complexes in vitro et utiliser des extraits cellulaires pour analyser les fonctions de Ded1. Les ARN associés seront aussi isolés et analysés entre autre par la technique du CRAC. Une approche génétique est également en cours pour identifier et caractériser d’autres partenaires potentiels, que nous pourrons ensuite analyser par des approches biochimiques et enzymatiques. Enfin, en collaboration avec une biologiste cellulaire, Naima Belgareh-Touzé, nous pouvons examiner la localisation cellulaire de la protéine dans différentes conditions de croissance. Ainsi, nous avons été les premiers à montrer la localisation nucléaire de Ded1. En combinant toutes ces données, nous espérons surtout comprendre quel est le rôle biologique de Ded1.

Ce projet regroupant 3 laboratoires avec chacun des expertises différentes mais complémentaires, devrait créer une synergie suffisante pour pouvoir mener à bien ce projet et comprendre comment les hélicases à ARN à boite DEAD fonctionnent et pourquoi elles sont si importantes (essentielles) dans l'expression génétique et la régulation cellulaire.