Reconstruction molécule-unique de la voie de réparation transcriptionellement-couplée de l’ADN – RepOne

Ce projet propose d’employer des méthodes “molécule-unique” pour reconstituer, dans une approche moléculaire composante-par-composante, la totalité d’une voie de réparation de l’ADN, celle de la réparation dite transcriptionnellement-couplée (ou "TCR").

La TCR est un processus-clef de la réparation de l’ADN qui emploie des composantes de la machinerie de transcription pour identifier des lésions dans l’ADN et initier leur réparation. Ce processus hautement conservé existe chez tous les êtres vivants; chez les humains il a récemment été impliqué dans la protection de l’ADN des lésions qui peuvent survenir dans les tissus de peau exposés a la lumièreUV, ou les cellules épitheliales du poumon exposées à la fumée de tabac. La TCR débute lorsque une ARN polymérase (RNAp) en cours de transcription rencontre une lésion encombrante sur l’ADN, par exemple le dimer thymine-thymine typiquement généré par les UV. La RNAp ne peut transcrire à travers la lésion et y “cale”. La RNAp, associée à l’ADN de façon extrêmement stable lors de la transcription, ne peut se dissocier du dégât et s’y retrouve coincé, empêchant les facteurs de réparation d’accéder au dégât. La RNAp calée recruite une hélicase de type superfamille-2 (SF2), qui chassera la RNAp de l’ADN puis recruter au site lésé, finalement accessibl,e des facteurs aval de réparation – exonucléase, hélicase, etc. Ainsi après coupure du brin d’ADN lésé de part et d’autre du dégât, le fragment est éliminé par une hélicase, permettant la resynthèse par l’ADN polymérase I d’un ADN frais et intact.

Cette description succincte souligne le fait que la TCR est un processus complexe, comportant de multiples composantes et de multiples étapes. Des travaux récents de notre laboratoire (“Initiation de la réparation transcriptionellement-couplée caractérisée à l’échelle de la molécule individuelle”, K. Howan et al., Nature 2012: 490: 431-434) ont permis de mettre au point de nouvelles méthodes expérimentales de type molécule-unique afin de débuter le processus de reconstruction moléculaire de la TCR telle qu’elle s’effectue dans la bactérie E. coli. En employant la nanomanipulation de molécule individuelle d’ADN, nous avons pu observer une molécule d’ARN polymérase initier la transcription puis se retrouver bloquée par un dégât d’ADN (un dimer thymine-thymine). En introduisant l’hélicase SF2 bactérienne, Mfd, responsable de l’initiation de la TCR, nous avons pu mesurer la vitesse à laquelle Mfd déplace la RNAp de l’ADN. Nous avons pu déterminer qu’après avoir déplacé la RNAp, Mfd reste sur l’ADN pendant un temps long et caractérisé par de faibles fluctuations (~5 +/-2 minutes (ecart-type)). Ces résultats sont cohérents avec le rôle joué par Mfd dans les évenements qui suivent, notemment dans le recruitement de la machinerie d’excision de l’ADN, UvrABC. En effet, il est finalement logique que si Mfd déplace la RNAp, qui se trouve être un remarquable marqueur de site lésé, alors il serait intéressant que Mfd reste longtemps sur l’ADN afin d’assurer le recrutement des facteurs avals au site lésé.

Ainsi dans ce projet nous proposons de poursuivre la reconstruction des étapes aval de ce processus en employant diverses techniques molécule-unique développées dans notre équipe au cours de ces dernères années (pince magnétique, pince optique, pince magnétique couplée à la détection de fluorescence molécule-unique). Les expériences proposées visent ainsi à caractériser 1) les propriétés structurelles et stochiométriques du complexe Mfd-ADN signalant un dégât, 2) l’assemblage et l’action des protéines UvrA/UvrB/UvrC sur ce complexe, 3) la cinétique d’incision de l’ADN et 4) l’élimination de l’ADN endommagé et l’évacuation des composantes restées sur l’ADN. Nous étudierons non seulement le système bactérien, mais également un système eukaryote, celui de la levure. Ces travaux nous fourniront une vision cinétique détaillée, mais néanmoins intégrative, des déterminants de la réparation de l’ADN.