Quantification à haut débit en milieu biologique : Alternative à la Radioactivité – MTaQ

La mise au point d’une technologie novatrice permettant la détection et la quantification d’analyte à l’échelle subnanomolaire représenterait un pas significatif pour la découverte et l’étude pharmacologique de nouveaux composés d’intérêt thérapeutique. La spectrométrie de masse moléculaire ou élémentaire peut fournir une piste particulièrement intéressante dans l’exploration de cette problématique. Ainsi, nous voulons développer dans le cadre de ce projet ANR MTaQ une méthode générique de détection et de quantification par spectrométrie de masse de molécules d’intérêt thérapeutique dans des cultures cellulaires. Nos efforts porteront particulièrement sur la mesure d’interactions faibles lors des expériences de liaison compétitives entre un récepteur et un ligand. Outre l’emploi des diverses techniques de spectrométrie de masse disponibles au sein du consortium (sources d’ionisation ESI, MALDI, ICP équipées d’analyseurs très sensibles qui permettent d’atteindre des seuils de détection très bas), un marquage chimique (tag/label) de l’échantillon lui-même est envisagé afin d’améliorer les seuils de détection et de quantification en spectrométrie de masse pour égaler les performances de la radioactivité. Les recherches ont débuté par un modèle récepteur/ligand peptidique (Vasopressine V1A recepteur / AVP). Le marquage du peptide AVP par une entité organique permettant d'exalter la détection en spectrométrie de masse MALDI-Tof a constitué la première voie d'exploration (spectrométrie de masse moléculaire) en accord avec le calendrier des tâches fixé. En parallèle, le marquage du peptide AVP par un ou plusieurs atomes de sélénium a été choisi afin de développer la seconde approche par spectrométrie de masse élémentaire (ICP-MS).

Les synthèses des ligands du récepteur V1a/AVP (ligand de référence du récepteur, peptide cyclique agoniste) et HO-LVA (peptide linéaire antagoniste) qui incorporent le marqueur chimique par introduction des modifications du coté N-terminal et par insertion d'aminoacides non-naturels possédant le marqueur ont été préparés avec succès. Les quantités disponibles et la pureté des échantillons obtenus ont permis d'aborder les tâches de spectrométrie de masse et de pharmacologie dans le calendrier imparti. ainsi, l’affinité pour le récepteur V1a des nouvelles molécules marquées a été vérifiée par liaison compétitive et déplacement du HO-LVA marqué à l’iode 125. De façon satisfaisante, tous les peptides marqués (à l’exception de l’AVP monosélénié) ont conservé des affinités du même ordre de grandeur que les ligands de référence. Nous avons donc en main des ligands éligibles pour mettre en œuvre les stratégies analytiques basées sur la spectrométrie de masse. La mise au point et le développement des protocoles d'analyse en spectrométrie de masse moléculaire (partenaire 1) et élémentaire (partenaire 2) ont été effectués en lien avec la pharmacologie pour disposer d'échantillons réels (cultures cellulaires) tout en se conformant dès le départ aux contraintes des expériences de liaisons compétitives. L'optimisation des protocoles opératoires de pharmacologie et de spectrométrie de masse a été nécessaire. Récemment, des expériences de liaisons compétitives à partir de préparations de membranes ont été menées avec les ligands AVP sélénié et les ligands HO-LVA marqués. Ces premières séries d'expériences montrent la faisabilité des approches envisagées. La robustesse de la technologie analytique basée sur la spectrométrie de masse moléculaire a été éprouvée par des outils de validation statistique. L'approche par spectrométrie de masse élémentaire nécessite encore des ajustements en cours d'étude.

L’optimisation de la détection en ICP-MS de peptides séléniés et de leur quantification par mise en oeuvre d'un couplage d'une technique séparative avec un spectromètre de masse ICP-MS va être poursuivie (CE-ICP-MS et LC-ICP-MS). Un nouvel instrument (LC-ICP-MS) présentant d’une part, une meilleure stabilité du plasma en condition d’élution à teneur élevée en solvant organique et d’autre part, une meilleure limite de détection du sélénium est en cours d’acquisition par le Partenaire 2. Les tests préliminaires ont montré qu’il était envisageable de gagner un facteur 10 en limite de détection. En parallèle, des synthèses de peptides marqués avec d’autres entités organiques et élémentaires vont compléter ces stratégies afin de pouvoir envisager une analyse directe (plus rapide) sans passer par une analyse LC-ICP-MS. Par ailleurs, nous avons choisi de débuter le projet par le modèle vasopressine mettant en jeu le couple ligand de référence AVP/et récepteur V1a. La validation du protocole sera effectuée dans un deuxième temps avec le récepteur CCK (ligand CCK4/CCKB) avant d'aborder un couple enzyme/inhibiteur (P38 MAP-kinase/ inhibiteur de type petite molécule hétérocyclique).

Publications en cours de rédaction sur chacun des axes du projet (spectrométrie de masse moléculaire et spectrométrie de masse élémentaire)

Le criblage pharmacologique à haut débit (HTS) s’est imposé comme un outil majeur dans la recherche et l'optimisation de molécules bioactives à visée thérapeutique. Toutefois, la mesure d’interaction entre un récepteur et un ligand nécessite des moyens de détection et de quantification puissants (Ki<10-8M). Le recours au radiomarquage de ligands de référence est souvent incontournable. L’utilisation de la radioactivité reste particulièrement délicate (laboratoire dédié, personnel formé, traitement des déchets) et est donc inadaptée aux stratégies à haut débit qui démultiplient le nombre d’essais et de déchets contaminés. Dans ce contexte, nous voulons développer une méthode générique de détection et de quantification de ligands de référence dans des milieux biologiques complexes à un niveau de concentration égalant les performances de la radioactivité. La spectrométrie de masse, moléculaire ou élémentaire, est une piste particulièrement intéressante dans l’exploration de cette problématique. En effet, cette technique est remarquable pour sa spécificité et sa sensibilité permettant la détection, l’identification et la quantification de biomolécules ou d'éléments chimiques dans des milieux complexes. Une première stratégie, appelée ‘Ligand quantification’, consiste en la conception et synthèse de nouveaux marqueurs chimiques universels qui pourront être liés à de multiples ligands de référence. Ces marqueurs devront favoriser la détection des molécules d’intérêt et permettre leur quantification par marquage isotopique. La seconde partie du projet met en œuvre une stratégie appelée ‘Probe quantification’. Au lieu de quantifier la molécule d’intérêt dans l’échantillon, nous cherchons à doser uniquement un marqueur. La nature chimique du marqueur sera optimisée pour qu’il produise en spectrométrie de masse moléculaire (ESI ou MALDI) un ion caractéristique et spécifique pouvant être obtenu soit par un traitement chimique ou biochimique simple de l’échantillon, soit par une fragmentation dans la source, et en spectrométrie de masse inorganique un élément par atomisation de l'échantillon (ICP-MS). Au contraire des méthodes décrites dans la bibliographie, suivant la nature du marqueur (ion préformé, élément chimique spécifique, exhausteur d’ionisation…), la quantification se fera par introduction d’un marqueur universel à toutes les expériences de dosage en ESI/MALDI-MS et de façon absolue en ICP-MS rendant ces stratégies génériques. Ces méthodes seront mises en œuvre, dans le cadre de tests de liaison compétitifs, sur deux modèles biologiques d’interaction ligand/récepteur (CCKB et MCR1), présentant des protéines membranaires insolubles et des peptides comme ligands naturels. Ensuite, afin d'élargir les perspectives de ce projet, des protéines solubles (telles que les P38 kinases) seront étudiées comme exemple de systèmes biologiques faisant intervenir, d'une part des protéines solubles et, d'autre part, des ligands naturels qui ne sont plus des peptides mais des petites molécules organiques hétérocycliques. D’un point de vue méthodologique, ce projet fait intervenir la synthèse de nouveaux marqueurs spécifiques pouvant être mis en évidence avec une sensibilité comparable à la radioactivité. Une mise au point très importante en spectrométrie de masse concernera le traitement d’échantillons biologiques, la détection de signaux spécifiques et la quantification de composés au sein d’un mélange. La réussite de ce programme facilitera l’étude des interactions moléculaires en proposant une alternative à la radioactivité sûre et respectueuse de l’environnement pouvant déboucher sur des applications industrielles importantes.