Régulation de l'immunité innée antivirale par la kinase IKKbeta chez la drosophile – IKAVIR

Les virus sont les agents infectieux les plus abondants sur Terre, et les maladies causées par ces pathogènes intracellulaires représentent une menace constante et une cause de mortalité importante dans le monde. La mouche drosophile est un modèle intéressant pour étudier les bases moléculaires et cellulaires de nombreux aspects de la biologie, y compris l’immunologie. Le but de ce projet est de comprendre les mécanismes de résistance contre les infections par les virus à ARN chez cet insecte modèle, et d’identifier de nouveaux acteurs de l’immunité antivirale. Nous avons ces dernières années montré que l’immunité innée antivirale chez la drosophile reposait sur l’ARN interférence et une réponse inductible. Cette dernière demeure mal caractérisée, mais semble être connectée avec la réponse ARN interférence.
Le groupe de Joëlle Vinh à l’ESPCI à Paris collabore depuis 2008 avec deux équipes de l’UPR9022 à Strasbourg, dans le but de caractériser les interactomes de deux voies importantes de défense de l’hôte, la voie IMD (collaboration avec H. Fukuyama et J. A. Hoffmann) et la voie de l’ARN interférence (collaboration avec J.-L. Imler). De façon inattendue, un nombre significatif d’interactants communs a été observé entre ces deux jeux de données protéomiques. Nous avons donc testé le rôle de la voie IMD dans l’immunité antivirale, et observé que la kinase DmIKKß (Drosophila melanogaster IkappaB kinase), mais pas sa sous-unité régulatrice DmIKKgamma, joue un rôle important dans le contrôle de l’infection par le virus C de la drosophile (DCV). IKKß est une kinase conservée au cours de l’évolution qui joue un role essentiel dans l’activation des facteurs de transcription de la famille NF-kB et qui est une cible prometteuse pour le développement de traitements contre l’inflammation. Cependant, la régulation de l’activité de cette kinase, et la façon dont elle est dirigée vers certains substrats plutôt que d’autres demeurent mal compris. Nous proposons dans ce projet d’utiliser une approche de protéomique fonctionnelle pour identifier de nouveaux co-facteurs de DmIKKß dans le contexte d’infections bactériennes et virales. Nous proposons d’utiliser le modèle de la drosophile comme paradigme pour comprendre la fonction et la régulation du complexe IKK. Ce projet s’appuie sur l’expertise unique présente dans les laboratoires de J. Vinh et J.-L. Imler pour mener conjointement des expériences fonctionnelles et des analyses protéomiques pour identifier rapidement des partenaires fonctionnels de cette kinase.
Nous avons construit des lignées cellulaires exprimant des versions étiquettées de DmIKKß ou DmIKKg. Nous les utiliserons pour purifier leurs partenaires, qui seront identifiés par nanoLC MS/MS. Ces expériences seront réalisées en absence d’infection, ou après infection par des bactéries (implication de DmIKKß et g) ou le DCV (implication de DmIKKß seulement). La fonction des molécules que nous identifierons sera étudiée dans des cellules en culture après inactivation de l’expression des gènes correspondants par ARN interférence. Les plus intéressants de ces gènes seront étudiés plus en détail in vivo, et la fonction de leurs orthologues mammifères sera étudiée dans des cellules humaines ou murines dans le cadre de collaborations existantes avec des laboratoires américain et japonais. Les échanges rapides d’information entre les laboratoires de Strasbourg et Paris permettra de mettre au point de nouvelles méthodes de protéomique ciblée, qui seront appliquées à (i) la quantification de molécules dans les complexes IKK au cours de l’infection ; (ii) la détection de modifications post-traductionelles comme la phosphorylation, et (iii) des expériences in vivo, sur des tissus disséqués de mouches sauvages ou mutantes.
Ces expériences permettront de mieux comprendre la fonction et la régulation d’un composant essentiel de la réponse inflammatoire.