Spécification et réalisation de l'identité musculaire chez la drosophile. – Muscle-Identity

Outre l’utilisation des nombreuses méthodes de génétique moléculaire et réverse développées chez la drosophile, notre équipe a été pionnière de l’hybridation in situ fluorescente permettant de déterminer les fenêtres temporelles de transcription de gènes ou de gènes rapporteur comportant un intron. Le nombre de points d’hybridation reflète la période de transcription et l’intensité de chaque point, son taux d’initiation (logiciel ImageJ), statistiques calculées avec le logiciel Prism 5.0. Nos expériences sont réalisées sur des embryons exprimant des protéines fluorescentes sous contrôle de modules cis-régulateurs de facteurs d’identité afin de visualiser la position des progéniteurs et le développement de muscles spécifiques par imagerie d’embryons fixes ou par imagerie du vivant. Cette stratégie est transposable à tout gène et tout tissu. Nous utilisons diverses stratégies basées sur Cas9/CRISPR pour modifier des gènes d’identité musculaire afin d’étudier les conséquences de telles mutations sur la locomotion.

Muscle-identity comportait 4 tâches.
1.Spécification de l’identité des progéniteurs musculaires; GRNs ?
2 cribles grande échelle ont montré que i) la date de naissance et l’identité d’un progéniteur musculaire sont régulées par la signalisation EGF ; ii) de nouveaux rôles « identitaire » d’orthologues des FTs myogéniques vertébrés MyoD, Eya and Six. Les fenêtres temporelles de transcription et les régulations croisées entre ces FTs et d’autres FTs identitaires procure une première vue dynamique et un nouveau cadre d’analyse du contrôle transcriptionnel de l’identité musculaire (de Taffin 2015; Dubois 2016).

2: Mémoire de l’identité au cours de la différenciation.
L’expression des TFs identitaires est contrôlée par l’activité séquentielle d’éléments cis-régulateurs (CRMs) initiateur et mémoire. La délétion ciblée de ces CRMs a révélé que la propagation de l’identité du myoblaste fondateur aux autres noyaux syncitiaux est essentielle au processus d’identité musculaire. En absence, il y a formation de muscles « branchés », un possible modèle d’étude de Duchenne Muscular Dystrophies, et des défauts de locomotion (A. Carayon, thèse, 2018; à soumettre).

3 : (Re)-Programmation des noyaux dans la fibre musculaire
Notre étude a montré que les noyaux des myoblastes autres que fondateurs sont « naifs » et reprogrammés après fusion. La transcription différentielle de gènes réalisateurs de l’identité musculaire est contrôlée aux niveaux du nombre de noyaux syncitiaux actifs et du taux d’initiation de la transcription. Le programme générique de myogenèse est régulé indépendamment. L’ensemble procure un nouveau cadre de lecture de la différenciation de cellules multinucléées (Bataillé 2017).

4: Evolution des patrons musculaires.
Nous avons découvert un nouveau type de muscles thoraciques reliant squelette et organes internes. Cette découverte soulève la question de l’origine évolutive de ces muscles et de leur fonction. (Boukhatmi 2014 ; Bataillé 2015, en préparation).

Nos cribles à l’échelle génomique chez la drosophile ont révélé une complexité inattendue du contrôle transcriptionnel de la diversité morphologique des muscles. Parmi les facteurs de transcription identifiés, des régulateurs généraux de la myogenèse mammifère. Ce résultat suggère que ces facteurs pourraient jouer un double rôle, général et identitaire chez les vertébrés, une question qui doit maintenant être abordée. D’autres régulateurs identifiés agissent à diverses étapes de la myogenèse et procurent de nouvelles pistes possibles d’étude de myopathies humaines.
La découverte de muscles thoraciques reliant squelette et organes internes ouvre un nouveau champ de recherche en myologie. Les premières questions à résoudre sont : quelles fonctions physiologiques de ces muscles, quelles propriétés les distinguant des muscles squelettiques classiques et quel mode d’innervation?.
Enfin, la dynamique de reprogrammation des noyaux dans la fibre musculaire en cours de différenciation non seulement apporte un éclairage nouveau sur l’intégration de la différenciation et l’identité musculaires, mais procure aussi un nouveau cadre d’étude de la régulation génique au sein des cellules multi nucléées.

Publications
$ co-first authors; * co-corresponding authors

Boukhatmi H. $, Schaub, C. $, Bataillé, L. $, Reim, I., Frendo,J.L., Frasch, M.* and Vincent, A.* (2014). An Org-1–Tup transcriptional cascade reveals different types of alary muscles connecting internal organs in Drosophila. Development, 141, 3761-3771.

De Taffin, M.$, Carrier Y.$, Dubois, L., Bataillé, L., Painset, A., Le Gras, S., Jost, B., Crozatier, M. and Vincent, A.* (2015) Genome-wide mapping of Collier in vivo binding sites highlights its hierarchical position in different transcription regulatory networks. PLoS ONE journal.pone.0133387

Bataille, L.*, Frendo, J.L., and Vincent, A.* (2015) Hox control of Drosophila larval anatomy; The Alary and Thoracic Alary-Related Muscles. Mechanisms of Development, 138, 170-176. (revue invitée)

Dubois, L.*, Frendo J.L., Chanut, H., B., Crozatier, M. and Vincent, A.* (2016) Genetic dissection of the Transcription Factor code controlling serial specification of muscle identities in Drosophila. eLIFE 2016;5:e14979

Bataille, L.*, Boukhatmi, H., Frendo, J.L., and Vincent, A.* (2017) Dynamics of transcriptional (re)-programming of syncytial nuclei in developing muscles. BMC Biology 15, 48-67.

Carayon, A. Thèse de doctorat- PhD thesis, Université de Toulouse (2018). Mise en place de l’identité musculaire durant la myogenèse embryonnaire chez la Drosophile.

Carayon, A., Bataille, L., Carrier, Y., Dubois, L., Lebreton, G., Wystrach, A., Vincent, A. and Frendo, J.L.* (2018) Loss of identity Transcription Factor activation in syncytial nuclei leads to branched muscles and locomotion defects. To be submitted, October 2018

Bataille, L.*, Colombié, N., Paululat, A., Frendo, J.L., and Vincent, A.* (2018) The Drosophila Alary muscles; a cornerstone of the heart. To be submitted, October 2018.

La musculature de chaque animal est composée d’un ensemble de muscles de morphologies très diverses. Elucider les mécanismes moléculaires et cellulaires à l’origine de cette diversité reste un défi des recherches en myologie. Notre programme de recherche vise à comprendre le contrôle de cette diversité en étudiant deux étapes de la myogenèse: i) la spécification de l’identité des progéniteurs musculaires (PC); ii) la réalisation de l’identité musculaire, c.a.d., la traduction de l’identité de chaque PC en morphologie spécifique.
Nous utilisons comme modèle d’étude la formation de deux muscles distincts chez la drosophile, un muscle dorso-latéral (DA3) et un muscle dorsal (DA2) qui expriment deux facteurs de transcription identitaires (iFTs) différents, respectivement Collier (Col) et Tail-up/Islet1 (Tup).
Notre premier objectif est d’identifier l’ensemble des facteurs de transcription (FTs) requis pour la spécification et la réalisation de l’identité musculaire par un crible génétique systématique couvrant les 3 chromosomes. Une étude pilote a révélé plusieurs types de changement d’identité du muscle DA3 correspondant à la perte d’un TF d’identité (iTF). Nous étudierons la fonction de ces iTFs afin d’établir les réseaux de régulation génique (GRN) contrôlant l’identité du muscle DA3 avant d’étendre cette analyse à d’autres muscles. Notre crible est le premier réalisé à l’échelle du génome, visant à identifier des combinatoires d’iTFs spécifiant l’identité musculaire.
L’activation d’iTFs spécifiques dans un PC reflète la position de ce PC le long des axes du corps. Nos travaux récents suggèrent l’intervention d’un mécanisme dit « de passage de témoin » entre 2 modules cis-régulateurs (CRMs): L’accumulation d’un ITF, sous le contrôle d’un CRM « positionnel », permet d’activer un CRM secondaire, « de mémoire », responsable du maintien de l’expression de l’iTF au cours de la croissance musculaire. Notre 2ème objectif est de tester ce mécanisme dans un contexte génomique normal. Pour élargir les conclusions tirées de l’expression de col, nous étudierons la régulation de tup et identifierons les TFs se liant aux CRM « de mémoire » par un crible d’interactions chez la levure. Cette étude permettra de comprendre comment l’information positionnelle intégrée au niveau de chaque PC est propagée à l’ensemble d’une fibre musculaire pour maintenir son identité.
Un 3ème objectif, majeur, est d’explorer le processus de reprogrammation transcriptionnelle des myoblastes « naïfs » incorporés dans la fibre musculaire. Nous développerons de nouvelles stratégies permettant de comparer les transcriptomes de fibres musculaires spécifiques et d’identifier des gènes cibles directs de Col et Tup dans ces fibres. Un des objectifs est de caractériser lesgènes requis pour l’attachement de chaque muscle à des cellules de tendon spécifiques. L’intégration de la dynamique de reprogrammation des noyaux et des aspects cellulaires de la différenciation des fibres musculaires apportera une vision intégrée de la réalisation de l’identité musculaire et du rôle des gènes cibles directs d’iTFs dans le contrôle de la morphologie spécifique à chaque muscle.
La précision du patron musculaire de la drosophile soulève la question des mécanismes d’évolution de ce patron. Notre 4ème objectif est à plus long terme. Il s’agit de comparer la morphologie et le code iTF des muscles entre 2 espèces de drosophile (larve ambulante), un moustique (larve aquatique) et l’abeille (larve sessile). Finalement, notre découverte récente que Tup agit comme iTF a révélé un parallèle intéressant entre les GRN mobilisés dans les muscles dorsaux de la drosophile, et les muscles pharyngaux des chordés. Nous poursuivrons l’étude de ce parallèle en collaboration avec des équipes externes.
L’ensemble de ces travaux permettra une vision globale de l’intégration des processus génériques et identitaires au cours de la différenciation musculaire.