Régulation des éléments transposables dans la lignée germinale: de la répression totale à la liberté surveillée. – plasTiSiPi

Les éléments transposables (ET) représentent 50% du génome humain et 20% du génome de la drosophile. Leur mobilisation dans les tissus somatiques induit des mutations et des réarrangements chromosomiques pouvant conduire à l’apparition de cancers et dans les cellules de la lignées germinales ces modifications peuvent être transmises à la génération suivante. L’activité des ET doit être donc bien contrôlée : dans la lignée germinale, cette répression s’effectue par des petits ARN de 23 à 28 nucléotides associés à des protéines de la famille PIWI (piRNA). Cependant, cette répression semble imparfaite au cours de l’ovogenèse ce qui pourrait conduire à de la diversité génomique au cours des générations. En ce sens, nous avons trouvé que la répression de deux ET, l’élément P et Idefix, est fortement diminuée dans la partie la plus antérieure des ovarioles au niveau d’une structure appelée le germarium qui contient les cellules en mitose. Corrélativement, nous avons découvert que Piwi est moins exprimé dans cette région qui a été appelée la piwiless Pocket ( pilp). En revanche, au cours de l’ovogenèse tardive, on observe une distribution de la répression de ces éléments bimodale claire (ON/OFF) indépendante de l’expression de Piwi, qui est toujours activé. Ainsi, la répression des éléments transposables montre à la fois une plasticité au cours de l’ovogenèse précoce et une mémoire cellulaire au cours de l’ovogenèse tardive. Notre premier objectif est d’étudier comment la répression par les piRNA peut réguler la répression des ET durant la différenciation cellulaire germinale, permettant ainsi une balance entre la protection de l'intégrité du génome et de sa plasticité. Pour cela, nous allons 1- analyser in situ l'expression des gènes de la voie des piRNA ainsi que l'expression des TE dans le pilp, 2- microdisséquer la région pilp et analyser les petits ARN par séquençage à haut débit, 3- exprimer ectopiquement Piwi dans la pilp et analyser l'impact sur l'ovogenèse, l'expression des gènes et l'activité des ET (dont les ET télomériques), 4- identifier la stabilité de la répression en utilisant des outils dérivés de la GFP, 5- transplanter des GSC uniques issues du germarium afin de suivre leurs capacités de répression au cours de l'ovogenèse tardive. La biogenèse des piRNA n’est toujours pas élucidée. Au cours d’un crible pour identifier des nouveaux gènes impliqués dans la différentiation des cellules de la lignée germinale, nous avons isolé un mutant du gène rpp30 qui aboli la biogenèse des piRNA. La protéine Rpp30 est une sous unité du complexe RNase P, impliqué dans la maturation endonucléolytique de pre-tRNAs. Notre second objectif est de comprendre le rôle de Rpp30 dans la biogenèse des piRNA. Deux hypothèses seront testées. Premièrement, la RNase P pourrait être directement requise pour couper les ARN précurseurs des piRNA. Deuxièmement, les fragments des tRNA (tRFs) générés par Rpp30 pourraient participer directement à la répression des TE ou participer à l’amplification des piRNA. Les tRFs constituent une nouvelle classe de petits ARN non codants conservés chez les vertébrés. Leur fonction reste inconnue. Nos recherches concerneront 1- la caractérisation de la localisation sub-cellulaire de Rpp30 ainsi que son profil d’expression au cours de l’ovogenèse, 2- l’analyse des protéines et ARN associés à Rpp30 par spectrométrie de masse et séquençage à haut débit, 3- la caractérisation des tRFs en différents contextes mutants, 4- la compréhension du rôle des tRFs dans la répression des ET. Le troisième objectif est transversal aux objectifs 1 et 2. Le but est 1- le managing, 2- l’exploitation de toutes les données de séquençage générées par les projets de profil de piARN, tRFs et ARNm , 3- de fournir de nouveaux outils de visualisation, 4- de développer un nouvel algorithme pour analyser les signatures de piARN au niveau du génome.