Exploitation de l’énergie solaire pour une production de Bio-Hydrogène dans un environnement naturellement micro-oxique chez la Cyanobactérie Anabaena PCC 7120. – CYANHY

• L’hydrogénase HydA est une métalloenzyme dont la maturation nécessite les trois protéines HydEFG. Pour garantir une maturation efficace de HydA dans l’hétérocyste, une stratégie basée sur la biologie synthétique a été choisie pour construire un opéron synthétique exprimant les 4 gènes hydAEFG de C. acetobutylicum. La transcription de cet opéron a été placée sous le contrôle d’un promoteur qui s’exprime de façon spécifique dans l’hétérocyste assurant ainsi la production de HydA dans ce type cellulaire adapté. L’expression correcte de cet opéron a été analysée par reverse transcription suivie d’une amplification quantitative. La production des quatre protéines Hyd a été étudiée par spectrométrie de masse.
• Afin de réduire la quantité d’oxygène dans l’hétérocyste et inhiber la consommation de l’H2 produit, une approche de génie génétique a permis de déléter ou de surproduire des gènes d’intérêt.
• La croissance des souches obtenues a été réalisée sous des conditions phototrophes et la production d’H2 a été suivie par chromatographie en phase gazeuse.

Nous avons réussi à atteindre l’objectif visé puisque la souche d’Anabaena produisant l’hydrogénase clostridiale a effectivement montré une production significative d’H2. Réduire le niveau d’O2 dans l’hétérocyste a permis d’obtenir une production d’H2 non seulement à partir de HydA mais également à partir des hydrogénases propres d’Anabaena. Nous avons ainsi montré qu’il était possible de créer des niches anaérobies chez un organisme aérobie et que cela permettait le fonctionnement d’enzymes sensibles à l’oxydation. Lors de ce projet, nous avons pu découvrir l’existence d’hydrogénases tolérantes à l’O2 chez des cyanobactéries. Ceci a permis l’obtention d’un nouveau contrat ANR et une labellisation en cours par le pôle de compétitivité « CapEnergies »

Notre étude a permis de cibler les points d’intervention possibles pour l’obtention d’une souche d’Anabaena optimale pour la production d’H2. Une des perspectives directes de ce projet serait donc l’optimisation de la souche obtenue en : * cumulant deux mécanismes différents de consommation d’O2, *supplémentant l’hétérocyste par des donneurs d’électrons clostridiaux * utilisant des mutants de régulation d’Anabaena produisant plus d’hétérocystes que la souche sauvage.
Une perspective parallèle au projet est l’étude et l’exploitation d’hydrogénases tolérantes à l’O2 chez les cyanobactéries.

La souche d’Anabaena produisant de l’H2 à partir de l’hydrogénase clostridiale a fait l’objet d’une publication dans la revue « Applied Microbiology and Biotechnology ». Une revue sur l’utilisation des Clostridies pour la production d’H2 a également été publiée dans « Applied Microbiology and Biotechnology ». La découverte des hydrogénases tolérantes à l’O2 a été publiée dans « Frontiers in Genetics » et deux autres publications sont en cours de soumission dans « Plos Genetics » et « ACS Synthetic Biology ».

De nos jours, le développement d’énergies renouvelables représentant des alternatives non polluantes au pétrole est devenu une nécessité absolue. Dans ce contexte, l'hydrogène (H2) constitue probablement le meilleur candidat pour un combustible efficace et écologique. La conversion de l'énergie solaire en H2 constitue une stratégie très attrayante pour la bioproduction de ce combustible. Pour cette raison, l'utilisation de micro-organismes photosynthétiques tels que les microalgues et les cyanobactéries, est expérimentée dans de nombreux pays à travers le monde. Toutefois, plusieurs verrous doivent être levés avant que des organismes photosynthétiques puissent être utilisés efficacement pour la bio-production d'H2. En effet, les enzymes cyanobactériennes et algales qui catalysent la production d'H2 ne permettent pas un très fort rendement en H2. Les hydrogénases telle que celles produites par les bactéries anaérobies strictes du genre Clostridium, sont très efficaces, et pourraient donc être de très bons candidats pour une production hétérologue dans des organismes photosynthétiques en vue d’une production efficace d’H2. Cependant, pour atteindre un tel objectif, deux problèmes majeurs doivent être résolus. La première barrière est la sensibilité de ces hydrogénases vis-à-vis de l’inactivation par l’oxygène (O2), qui résulte en une incompatibilité de leur production dans des organismes produisant de l’O2 via la photosynthèse. La seconde contrainte à contourner est le besoin de développer un système de criblage à haut débit pour l'optimisation de souches de cyanobactéries pour la production d’H2. Dans ce projet, nous nous proposons d'apporter des solutions à ces deux problèmes en utilisant la cyanobactérie filamenteuse diazotrophe Anabaena PCC 7120. Sous certaines conditions, cet organisme peut former deux types cellulaires distincts: * les hétérocystes dédiés à la fixation d’azote atmosphérique (N2) et qui forment un micro-environnement micro-oxique permettant le fonctionnement de la nitrogénase sensible à l'oxygène, *les cellules végétatives qui effectuent la photosynthèse oxygénique et qui soutiennent ainsi les hétérocystes pour la fixation du N2. Nous proposons de produire de façon hétérologue l’hydrogénase à [FeFe] HydA de Clostridium acetobutylicum dans les hétérocystes d’Anabaena. Notre stratégie a ainsi l’ambition de concilier dans une même bactérie et en autotrophie 2 réactions biochimiques incompatibles : la photosynthèse oxygénique et une production efficace d’H2. Nous nous proposons également de développer un système Bio-senseur d’H2 qui nous servira de crible génétique de souches recombinantes d'Anabaena optimisées dans leur capacité à produire l’H2. La combinaison de ces deux approches devrait nous permettre d'explorer et de maximiser la possibilité d'utiliser les cyanobactéries pour la conversion efficace de l'énergie solaire en H2.