Induction et réversion de translocations chromosomiques pour comprendre la tumorigenèse: les modèles du sarcome d’Ewing et du lymphome anaplastique à grandes cellules (ALCL) – InRevTrans

Nous avons mis au point une stratégie innovante pour créer de nouveaux modèles d’étude de cancers porteurs de translocation. Pour cela nous induisons deux cassures spécifiques de l’ADN sur deux chromosomes hétérologues dans des cellules humaines à l’aide d’outils moléculaires appelés nucléases. Ainsi nous reproduisons les translocations exactes trouvées chez les patients atteints de ces cancers. Cette approche permet alors l’échange de morceaux des chromosomes transloqués et donc la création de translocations chromosomiques dans les cellules pour étudier la formation de tumeurs éventuelles.

Nous avons montré que nous pouvions recréer les translocations retrouvées dans le sarcome d’Ewing et dans le lymphome anaplasique à grandes cellules, deux cancers dans lesquels une translocation est mise en évidence (Piganeau et al , Genome Research 2013). Nous sommes en train avec ces modèles cellulaires d’identifier quels sont les facteurs secondaires nécessaires à la transformation tumorale. Ceci pourrait être utilisé dans le futur comme prédiction de facteurs de risque par exemple dans le cas de leucémies secondaires induites par des thérapies. En parallèle, grâce à cette méthode nous avons aussi caractérisé le mécanisme moléculaire de formation des translocations dans les cellules humaines (ce qui n’était pas directement lié au projet de départ). De façon importante le mécanisme moléculaire de formation de ces événements oncogéniques semble distinct de celui reporté pour les cellules murines. Ceci implique que les cellules humaines utiliseraient des mécanismes spécifiques pour maintenir l’intégrité de leur génome et prévenir l’apparition d’éventuelles tumeurs (Ghezraoui et al, Mol Cell 2014).

Grâce aux résultats obtenus, nous nous attachons maintenant à caractériser les réponses cellulaires associées à la formation des translocations chromosomiques t(11 ;22) et t(2 ;5). Nous sommes en train d’isoler des populations cellulaires avec ces translocations pour étudier leur devenir et étudier quelles sont les voies activées par les gènes de fusion (étude des transcriptomes) ainsi que la tumorigenèse associée ; En effet, nous avons pu observé que l’expression du gène de fusion ne donnait pas un avantage prolifératif évident aux cellules transloquées et la nécessité d’acquisition d’événement secondaire reste une question ouverte (Fig3, cas du sarcome d’Ewing).L’identification de ces facteurs pourraient être utilisé comme un outil de diagnostique et de facteur de risque.

Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining
Hind Ghezraoui1, Marion Piganeau1, Benjamin Renouf1, Jean-Baptiste Renaud1, Annahita Sallmyr2, Brian Ruis3, Sehyun Oh3, Alan Tomkinson2, Eric A. Hendrickson3, Carine Giovannangeli1, Maria Jasin4* and Erika Brunet1*; Molecular Cell, accepted July 2014

Cancer translocations in human cells induced by zinc finger and TALE nucleases,
Piganeau, M., Ghezraoui, H., De Cian, A., Guittat, L., Tomishima, M., Perrouault, L., Rene, O., Katibah, G., Zhang, L., Holmes, M., Doyon, Y., Concordet, J. P., Giovannangeli, C., Jasin, M., and Brunet, E. Genome research (2013)

Les translocations chromosomiques sont la signature de nombreux cancers et sont retrouvées dans des lymphomes, sarcomes et même dans les carcinomes. Ces événements sont le résultat de l’échange de morceaux de chromosomes et sont considérés comme l’événement initial de ces tumeurs. D’un point de vue mécanistique, il a été montré que les translocations résultent de deux cassures d'ADN double-brin simultanées. Cet échange peut produire une nouvelle protéine dite de fusion (présente à la jonction des chromosomes transloqués) ou à la surexpression d’un oncogène préexistant. Le lien direct entre la formation de la translocation et la tumorigenèse n’est pas toujours établi, en particulier dans le cas de la formation d’une nouvelle protéine chimère. La plupart des études sont basées sur l’utilisation de la surexpression du gène de fusion en général dans des cellules de souris. Elles peinent souvent à reproduire les maladies humaines. Dans ce projet, nous proposons une stratégie innovante pour induire, dans des cellules humaines primaires choisies, des translocations retrouvées dans des tumeurs. Nous utilisons la stratégie reposant sur l’utilisation de nucléases artificielles, telles que les ZFN (nucléases à doigts de zinc) ou les TALEN (nucléases Transcription Activator- Like Effector). Le coordinateur du projet a en effet montré dans ses études précédentes qu’il était possible d’induire des translocations chromosomiques dans des cellules humaines primaires et souches. Cette stratégie permet de reproduire exactement l’environnement génomique de la translocation, avec l’échange de morceaux de chromosomes, contrairement aux stratégies utilisant la surexpression de la protéine induite par la translocation. De plus, dans notre stratégie le gène de fusion est alors exprimé sous son promoteur endogène et l’haplo-insuffisance résultant de la perte de l’intégrité d’un chromosome homologue est reproduite. Le but de ce projet est de répondre aux questions : 1- Que fait réellement la translocation au niveau cellulaire ? Quelles sont les conséquences de l’expression d’un nouveau gène de fusion ? 2- Comment la présence de la translocation induit la formation de la tumeur ?. Pour répondre à ces questions, nous allons utiliser deux modèles tumoraux : le sarcome d’Ewing et le lymphome anaplastique à grandes cellules (ALCL), qui ont chacun pour signature une translocation spécifique. Dans les deux cas, la relation directe entre l’expression du gène de fusion et la tumorigenèse n’est pas complètement définie. C’est pourquoi nous proposons de recréer ces translocations à l’aide de nucléases. Des résultats préliminaires obtenus par le porteur du projet montre déjà que l’on peut reproduire la translocation d’Ewing dans des cellules mésenchymateuses souches, avec l’expression de la protéine de fusion. Nous avons aussi conçues des nucléases pour reproduire la translocation présente dans les tumeurs ALCL . De plus, ces nucléases permettent également de reverser la translocation directement dans des cellules tumorales ALCL. Ces deux stratégies, induire et reverser une translocation présente dans des tumeurs, vont nous permettre de comprendre quelles sont les conséquences cellulaires de la présence de la translocation et de ces gènes de fusion, grâce à des analyses transcriptomiques et d’expression de miRNA. De même, ces approches vont nous permettre d’identifier si des événements oncogéniques additionnels, en dehors de la présence de la translocation, sont nécessaires à la tumorigenèse.