RCPG oligomériques: Faits et fonction dans le cas du récepteur GABAB – GABAplEx

Ce projet est basé sur l'utilisation de méthodes innovantes permettant de 1) analyser la stœchiométrie de liaison des ligands dans un complexe protéique; 2) l'analyse des changements conformationnels; et 3) la quantification du nombre de protéines au sein de complexes protéiques à la surface des cellules. Pour l’analyse de la stœchiométrie de liaison nous avons utilisé des ligands fluorescents et fait des mesures de transfert d’énergie. Afin d’étudier les changements conformationnels au sein d’un complexe dimérique de RCPG, nous avons utilisé des approches de marquage des sous unités avec des tag Snap, Clip ou ACP qui peuvent être marqués de façon covalente par des fluorophores sous leur forme spécifiquement réactive. Nous avons utilisé des fluorophores compatibles avec le phénomène de lanthanide resonance energy transfert (LRET), quantifié par une technique de mesure de transfert d’énergie en temps résolu (TR-FRET). Nous avons ainsi pu identifier plusieurs mouvements conformationnels au sein du complexe récepteur GABAB, constitué des deux sous-unités GABAB1 et GABAB2. Pour l’étude de la formation des complexes protéiques, nous avons mesuré les signaux de fluorescence des sous-unités selon trois modalités : 1/ mesure de TR-FRET en population sur cultures cellulaires en microplaques ; 2/ mesure de TR-FRET à l’aide d’un microscope expérimental; 3/ par microscopie grâce à la technologie « Number and Brightness » pour déterminer la stœchiométrie des récepteurs GABAB et mGlu2 taggés et exprimés dans des neurones en culture. Cette technique permet de déterminer le nombre de fluorophores qui co-diffusent dans le champ d’observation d’un volume de quelques femtolitres, et donc la stœchiométrie des récepteurs étudiés. Afin de quantifier le niveau d’expression des récepteurs mGlu2 recombinants et endogènes, nous avons utilisé des anticorps simple chaîne (nanobodies) spécifiques de ce récepteur et que nous avons récemment validés.

Une première étude a permis de comprendre une des bases à l’origine du contrôle négatif d’un récepteur hétérodimérique GABAB sur partenaire après assemblage. Nous montrons en effet qu’il existe une forte coopérativité négative conduisant à la fixation d’un seul ligand par complexe tétramérique du récepteur GABAB. Dans une deuxième étude, nous avons pu identifier les mouvements inter et intra-sous unité au sein du complexe récepteur hétérodimérique GABAB liés à son activation. Nous avons montré que ces mouvements sont de bien moindre amplitude que de ceux observés chez les récepteurs similaires que sont les récepteurs mGlu. Ces études nous ont permis de montrer que les trois modulateurs allostériques commerciaux n’ont pas les mêmes effets sur la conformation du complexe hétérodimérique. Dans une dernière étude, nous avons confirmé que le récepteur GABAB forme des oligomères de plus de 4 sous-unités à des niveaux d’expression physiologiques dans les neurones, alors que le récepteur mGlu2 pour un niveau d’expression similaire reste un dimère strict. Cependant, nous avons montré que ce récepteur formait des complexes plus grands de 2 voir 3 dimères lorsqu’il est activé ou inactivé par des ligands. Nous proposons que la dynamique structurale constante et basale que nous avons observée précédemment limite le nombre de récepteurs dans un état conformationnel compatible avec l’association de plusieurs dimères. Au contraire, cette association est possible quand cette dynamique est supprimée lors de la fixation d’un ligand, permettant aux récepteurs de s’assembler, et ainsi aussi de s’autostabiliser. Nous proposons donc que ce phénomène contrôle les cinétiques d’activité du récepteur.

Grâce à la validation de nouvelles approches pour analyser les changements conformationnels des complexes protéiques, ainsi que l’analyse de leur stœchiométrie dans des cellules natives, nos résultats ouvrent de nombreuses perspectives. Tout d’abord sur l’application de ces technologies à de nombreux autres systèmes de transduction impliquant d’autres récepteurs ou canaux ioniques. Nos résultats confirment que le récepteur GABAB est majoritairement associé en oligomères plus grands que deux hétérodimères, mais l’importance fonctionnelle de ce phénomène reste à identifier. Nous pensons que cela permet de contrôler le niveau d’activité du récepteur GABAB, son association en oligomères limitant son activité. Notre observation que le récepteur mGlu2 peut, dans des conditions de stabilité conformationnelle, s’assembler en complexes plus grands est aussi surprenante, et soulève des questions importantes quant à l’implication physiologique de ce phénomène. Enfin, les outils chimiques et biotechnologiques qui ont été développés grâce à notre collaboration avec la société CisBio offrent de nouvelles perspectives de développement d’outils originaux pour cette entreprise. Non seulement les outils chimiques leur permettront de développer des kits originaux, mais aussi la validation de nouveaux biosenseurs constitue pour eux des pistes intéressantes de développement. Démontrer leur faisabilité et leur potentiel constitue sans nul doute une ouverture au développement de kits originaux intéressants.

Ce travail à conduit à plus d’une dizaines de présentations dans des congrès nationaux et internationaux, ainsi qu’à trois publications originales majeures, la première (Stewart et al.) montre qu’il existe une forte coopérativité négative entre les dimères du récepteur GABAB, la deuxième (Lecat-Guillet et al.) identifie les changements de conformation à la base du processus d’activation du récepteur hétérodimérique GABAB, et le troisième (Møller et al.) montre que le récepteur mGlu2 peut s’assembler en complexes de 2 à 3 dimères dans les neurones lorsqu’il est stabilisé dans un état conformationnel donné, actif ou inactif. Deux articles de revue sur invitation ont également été publiés sur ce thème, dont l’un (Pin and Bettler) dans la revue Nature, ainsi qu'un chapitre de livre. 1. Stewart GD, Comps-Agrar L, Nørskov-Lauritsen L, Pin J-P, Kniazeff J (2018) Allosteric interactions between GABAB1 subunits control the ligand binding site occupancy and the G protein-coupling efficacy within GABAB oligomers. Neuropharmacology:under revision. 2. Møller TC, Hottin J, Clerté C, Zwier JM, Durroux T, Rondard P, Prezeau L, Royer CA, Pin J-P, Margeat E, Kniazeff J (2018) Structural dynamics of a GPCR controls its oligomerization status in neurons.In preparation. 3. Møller TC, Moreno-Delgado D, Pin J-P, Kniazeff J (2017) Class C G protein-coupled receptors: reviving old couples with new partners. Biophysics Reports. 4. Lecat-Guillet N, Monnier C, Rovira X, Kniazeff J, Lamarque L, Zwier JM, Trinquet E, Pin JP, Rondard P (2017) FRET-Based Sensors Unravel Activation and Allosteric Modulation of the GABAB Receptor. Cell Chem Biol 24:360-370. 5. Pin J-P, Bettler B (2016) Organization and functions of mGlu and GABAB receptor complexes. Nature 540:60-68. 6. Kniazeff J, Rovira X, Rondard P, Pin J-P (2016) Activation mechanism and allosteric properties of the GABAB receptor. In: GABAB receptor, The Receptors (Colombo G, ed), pp 93-108: Humana Press.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) sont des protéines clés de la communication cellulaire. Bien qu’ils soient capables d’activer les protéines G sous une forme monomérique, ces récepteurs ont la capacité de former des dimères ou des oligomères d’ordre supérieur générant ainsi des complexes ayant des propriétés spécifiques. Cependant, la pertinence physiologique de l’oligomérisation reste peu caractérisée en systèmes natifs. Le récepteur GABAB - RCPG du principal neurotransmetteur inhibiteur GABA – constitue un modèle de choix pour l’étude de l’oligomerisation des RCPGs. En effet, ce récepteur est non seulement un hétérodimère obligatoire constitué des sous-unités GABAB1 et GABAB2, mais il peut également former des entités oligomériques via l’interaction directe des sous-unités GABAB1 comme nous l’avons récemment démontré dans des cellules transfectées et dans des extraits de cerveau.
Le but de ce projet est 1) d’identifier les diverses stoechiométries possibles pour les oligomères de GABAB à différentes localisations subcellulaires et 2) de déterminer la signification fonctionnelle de ces différents oligomères.
Le premier objectif nécessite la mise en œuvre de technologies innovantes dont les microscopies de FRET en temps-résolu et de fluctuation de fluorescence à deux photons. Le marquage des sous-unités GABAB sera réalisé soit, pour les sous-unités natives, par des ligands et anticorps fluorescents, soit à l’aide de substrats fluorescents pour le marquage covalent des sous-unités fusionnées aux snap et exprimées dans les cultures par vecteurs lentiviraux. L’effet sur l’oligomérisation de différents facteurs, tels la phosphorylation du récepteur ou les protéines d’interaction intracellulaires, sera étudié.
Le second objectif inclue le développement d’outils moléculaires qui empêchent la formation des oligomères du récepteur GABAB soit en mutant l’interaface GABAB1-GABAB1, soit en caractérisant des peptides de compétition. Les propriétés fonctionnelles et pharmacologiques des dimères stricts et des oligomères seront alors analysées. D’abord, en développant un senseur FRET d’activation du récepteur GABAB, nous analyserons l’influence, au sein de l’oligomère, de l’activation d’un dimère sur le processus d’activation du second. Ensuite, une analyse systématique de l’ensemble des voies de signalisations activées par le récepteur GABAB sera réalisée. Enfin, des animaux transgéniques exprimant uniquement les hétérodimères stricts du récepteur GABAB seront générés. La stoechiométrie des complexes sera vérifiée par TR-FRET et microscopie de fluctuation de fluorescence à deux photons puis les conséquences fonctionnelles seront examinées par études comportementales et en enregistrant les effets dépendants du récepteur GABAB sur l’activité synaptique.
En utilisant des technologies et des outils de pointe développés en partenariat avec une biotech, cette étude apportera la première démonstration claire et l’existence et de la pertinence physiologique des oligomères du récepteur GABAB. Ce projet apportera également de nouvelles stratégies pour aborder de telles problématiques pour les autres protéines multimériques de la surface cellulaire.