Biologie structurale de la modification et de l l'assemblage de la chromatine – Epistruct

Nous allons étudier la reconnaissance mulivalente de la chromatine par le domaine BP. Nous allons déterminer la spécificité de substrat du domaine bivalent BP de p300 et de déterminer la structure de co-cristaux de BP avec les substrats. Nous avons utilisé des étalages peptidiques qui contiennent des modifications des histones peptidiques afin de dépister une spécificité de substrat BP. Nous avons trouvé que les modifications qui sont associés à la chromatine transcriptionnellement actif tels que H3K14K18 acétylé et H3K27 sont liés par le domaine BP. Nous envisageons maintenant de confirmer la spécificité de substrat par le ITC.

Nous avons trouvé que le module BP se lie préférentiellement à des queues d'histones diacétylés. Nous avons réussi de cristalliser le module BP dans la présence de peptides d'histones mais les résultats préliminaires montrent que ces cristaux diffractent seulement a 15A. Nous avons également commencé à enquêter sur la spécificité de substrat du module BP in vivo. Nous avons conçu des mutants dans la p300 et analysé la localisation des GFP-p300 mutants par microscopie à fluorescence. Nous avons également mis en place un test pour l’activité de la p300 in vivo. On a constaté que nous pouvons utiliser ce test pour contrôler l'effet de p300 mutants in vivo.

Personnel pour ce projet a été recruté et en collaboration avec d'autres membres du laboratoire a produit d'importants résultats préliminaires. Nous avons fait du progrès important avec la structure du ‘noyau’ de la p300 et la majorité de nos efforts sont maintenant dirigés vers l'analyse fonctionnelle. Ces résultats seront également importants pour la conception de nouveaux inhibiteurs avec une variété d'applications potentielles. Des mutations dans CBP/p300 sont associées à un certain nombre de pathologies, y compris le syndrome de Rubinstein-Taybi et les tumeurs hématopoïétiques et épithéliales. La grande majorité de ces mutations sont localisées dans le noyau catalytique de CBP/p300 et affectent l'activité de l’acétyltransférase et le ciblage de la chromatine. Nos données structurelles ouvriront des possibilités pour la conception de médicaments soit par inhibition du ciblage de la chromatine (Bromodomain, PHD domain) ou en inhibant l'activité de l’acétyltransférase.

Nous sommes en train de préparer deux manuscrits différents l'un sur la structure et la régulation de p300 et un autre sur l'assemblage des complexes Nap1/histone. Le dernier manuscrit comprend des données de la microscopie électronique (Guy Schoehn) et de la spectrométrie de masse non-dénaturant (Carol Robinson). Le document sera rédigé conjointement.

Le remodelage de la chromatine non permissive est une caractéristique de l'expression des gènes eukaryotes. Le remodelage nécessite des enzymes de modification des histones telles que les histones acétyltransférases (HAT) et les protéines chaperons d'histones. Les enzymes HAT acétylent de façon post-traductionnelle certains résidus lysine des histones et d'autres protéines. Bien que le lien entre la modification des histones, le remodelage de la chromatine et la régulation des gènes ait été établi, les mécanismes biochimiques restent controversés. À ce jour, il ya deux modèles qui expliquent comment les modifications des histones conduisent à l'activation de la chromatine. Dans le premier modèle, les modifications des histones induisent des changements dans les propriétés physiques du nucléosome qui conduisent à une fibre de chromatine plus détendue. Dans le second modèle, les modifications covalentes des histones agissent comme des « marques » permettant le recrutement de différents complexes de modification de la chromatine. Ensemble, ces modèles sont à la base de l'hypothèse du «code histone». Celui-ci postule que les multiples modifications covalentes des queues des histones agissent de façon combinatoire pour moduler la structure de la chromatine et également pour entraîner le recrutement de différentes classes des protéines dont certains domaines distincts reconnaissent ces « marques » épigénétiques. Les chaperons d'histones constituent une classe extrêmement diversifiée de protéines acides qui jouent un rôle dans la fixation des histones et dans l'assemblage et le désassemblage des nucléosomes. Ce projet porte sur ce nouveau concept, à savoir que les activités des chaperons d'histones et des enzymes HAT agissent en synergie pour moduler la structure de la chromatine. Nous souhaiterions savoir si le transfert des histones par des chaperons nécessite l'acétylation des histones et si les enzymes HAT régulent l’activité des chaperons d'histones. Par ailleurs, nous proposons d'étudier le rôle des « domaines lecteurs de la chromatine » de certaines protéines effectrices dans la reconnaissance multivalente de la chromatine ainsi que dans la régulation des enzymes HAT. Nous allons examiner l'hypothèse que la fixation multivalente de la chromatine modifiée est au cœur du «code histone ». Les expériences de cette proposition donnent un aperçu de l'interconnexion entre l'acétylation des histones, l'assemblage et le désassemblage des nucléosomes et de contrôle épigénétique de la transcription des gènes.