Rôle du NSD/NGD: identification des gènes cibles et des facteurs impliqués dans ces mécanismes chez Saccharomyces cerevisiae – NGD-NSD

Pour décrypter les mécanismes de surveillance cytoplasmiques présentés ci-dessus, notre projet comprend deux volets :
L’un vise à identifier et caractériser les différents acteurs moléculaires engagés dans ces voies de régulation. Pour cela nous utilisons des approches classiques de génétique, biochimie et de biologie moléculaire. Nous avons sélectionné et identifié plusieurs mutants impliqués dans ces voies de dégradation des protéines aberrantes. Nous caractérisons biochimiquement les macrocomplexes impliqués et nous appliquons des tests fonctionnels spécifiques afin de définir le rôle des différents partenaires protéiques associés.
L’autre vise à identifier les cibles de cette régulation à échelle génomique. Pour cela, nous avons mis en place une combinaison d'approches innovantes. Nous avons développé des approches qui permettent d'étudier l'expression des gènes à l'échelle de la cellule. Ainsi nous allons combiner des approches transcriptomiques (pour étudier la transcription de tous les ARN d'une cellule), à des approches traductomiques (pour déterminer la quantité et la position de tous les ribosomes sur les ARNm de la cellule). Ces approches sont associées à des approches de protéomique afin d'analyser le contenu en protéines de la cellule. Ces trois approches couvrent toutes les étapes de l'expression génique et devraient nous permettre d'identifier, notamment au moyen d’analyses bioinformatiques, les sites de blocage des ribosomes et ainsi identifier les gènes cibles de ces voies de dégradation. L'utilisation de mutants des voies NGD/NSD nous permettra de mieux définir leur importance physiologique.

Nous avons caractérisé un nouveau complexe impliqué dans la dégradation des peptides issus de la traduction d'ARNm aberrants. Cette caractérisation a été réalisée grâce à la combinaison d'approches génétique et biochimique et a permis de préciser les étapes menant à la dégradation de peptides toujours associés aux ribosomes. Ces résultats sont important car ils permettent non seulement d'identifier précisément les acteurs impliqués dans la dégradation des peptides issus de la NSD, mais aussi car ils permettent de préciser les étapes entre l'arrêt de la traduction et la dégradation du peptide néosynthétisé.

Les perspectives ouvertes par une meilleure compréhension du couplage entre traduction et dégradation des ARNm/proteines se situent principalement d'un point de vue fondamental. En effet, ces voies pourraient constituer une nouvelle étape de la régulation des gènes, or leur importance dans la régulation de l'expression génique est actuellement très peu connue.
Il est encore trop tôt pour parler d'impact sociétal ou environnemental.

1. Baudin-Baillieu A et al. Translation analysis at the genome scale by ribosome profiling. «Methods in molecular biology«. Editor: Frederic Devaux. Springer. sous press

2. Baudin-Baillieu A, Legendre R, Kuchly C, Hatin I, Demais S, Mestdagh C, Gautheret D, Namy O.
Genome-wide Translational Changes Induced by the Prion [PSI(+)].
Cell Rep. 2014 Jul 24;8(2):439-48.

3. Fromont-Racine M and Saveanu C, 2014 mRNA degradation and decay «Fungal RNA biology«. Coeditors: Ane Sesma and Tobias von der Haar. Springer Verlag, Heidelberg. 159-193

4. Defenouillère Q, Yao Y, Mouaikel J, Namane A, Galopier A, Decourty L, Doyen A, Malabat C, Saveanu C, Jacquier A, Fromont-Racine M. Cdc48-associated complex bound to 60S particles is required for the clearance of aberrant translation products. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26;110(13):5046-51.

Chez les eucaryotes, la stabilité des ARNm joue un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes ainsi que dans la lutte antivirale. Par ailleurs, des données récentes, obtenues par RNA-Seq montrent qu’une quantité significative de gènes subissent des évènements de clivage et polyadénylation précoces qui doivent être éliminés. L'intégrité des ARNm est vérifiée grâce à différents mécanismes de contrôle de qualité ayant pour objectif d'éviter l'expression de protéines aberrantes dont certaines pourraient avoir une action délétère. Parmi ces mécanismes, deux nouvelles voies de dégradation, la "non stop decay" (NSD) et la "no-go decay" (NGD) ont récemment été identifiées chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Elles dépendent de l'état traductionnel de l'ARNm concerné: la NSD cible des ARNm ne possédant pas de codon stop ou des ARNm sur lesquels le ribosome a franchi le codon stop. Dans les deux cas, le ribosome bloqué à l'extrémité 3' de l'ARNm, constitue le signal déclenchant la NSD. La NGD cible les ARNm qui possèdent un ribosome bloqué ou ralenti, durant son cycle de traduction. La NGD et la NSD provoquent la dégradation rapide de l'ARNm, la dissociation du ribosome bloqué ainsi que la dégradation du peptide synthétisé (appelé NGP ou NSP).
Très peu de facteurs impliqués dans ces deux voies ont été décrits jusqu'à présent. Récemment, un modèle selon lequel le complexe Dom34p/Hbs1p se fixerait au site A vide du ribosome a été proposé pour la NGD. L'ARNm subirait une coupure endonucléolitique, puis serait dégradé par l'exosome et probablement décoiffé pour limiter l'initiation traductionnelle. Dans la NSD, c'est la protéine Ski7p qui se fixerait au site A du ribosome et recruterait le complexe exosome-ski. Bien que ces protéines jouent un rôle majeur, il est probable que d'autres facteurs soient aussi impliqués. Les mécanismes de dégradation des peptides issus de cette traduction reste encore très mystérieux. A l’heure actuelle, un seul facteur, l’E3 ubiquitine ligase, Ltn1, ciblant le peptide aberrant vers le protéasome a été identifié. Des résultats préliminaires obtenus par l’équipe 2 indiquent que d'autres facteurs sont impliqués dans cette dégradation.
Notre projet a pour objectif : i) d’analyser l’impact global de ces voies dans l’expression des gènes; ii) d'identifier chez la levure Saccharomyces cerevisiae les gènes cellulaires régulés par la NGD/NSD et iii) de caractériser les nouveaux facteurs impliqués dans la dégradation des protéines aberrantes (NSP ou NGP). Pour atteindre ces objectifs nous allons développer des approches de transcriptomique, traductomique et protéomique pour identifier les ARNm et les protéines accumulés dans des souches défectives pour la NGD/NSD (équipes 1, 2, 4). A partir de ces données, une analyse bioinformatique permettra de caractériser les motifs d'ARN communs à ces gènes, conduisant à la mise en place de la NGD/NSD (équipe 3). Ces signaux seront ensuite expérimentalement validés puis recherchés dans le génome de S. cerevisiae, afin de déterminer quels sont les gènes les utilisant (équipes 1 et 3). En parallèle, une caractérisation fonctionnelle et moléculaire des gènes identifiés par les approches globales sera entreprise par les équipes 1 et 2. Enfin, l’identification et la caractérisation des facteurs impliqués dans la dégradation des protéines NSP/NGP vont être effectuée.
Tous ces résultats contribueront à une meilleure compréhension de ces mécanismes de contrôle conservés chez les eucaryotes. Ils fourniront aussi de précieuses informations sur les facteurs impliqués dans la dégradation des protéines aberrantes, qui représente aussi une étape importante des contrôles de qualité, afin d'éviter l'apparition de maladies liées au mauvais repliement des protéines (telle que l'a-synucléine dans la maladie de Parkinson).