Génération de souris portant une mutation ciblée de l’ADN mitochondrial – Mito-Mouse

La société CELLECTIS nous a fourni deux MégaNucleases reconnaissant une séquence spécifique de l’ADN mitochondrial murin.
Nous avons manipulé cette MN pour l’adresser à la matrice mitochondriale.
Le concept consiste ensuite à exprimer d’une manière contrôlée cette MN afin d’éliminer progressivement les séquences sauvages de l’ADNmt pour sélectionner des copies de l’ADNmt mutées résistantes à l’action de la MN. A partir des clones que l’on espère isoler prochainement, nous vérifierons la séquence du fragment d’ADN ciblé par la MN, puis générerons une lignée de souris présentant la mutation dans cette séquence reproduisant une mutation humaine pathogène.

Au cours de la première moitié de ce projet, nous avons montré que la MN pouvait être spécifiquement adressée à la matrice mitochondriale, et qu’effectivement l’enzyme coupait l’ADNmt au site initialement prévu. Cette coupure double brin entraine une dégradation progressive de l’ADNmt, conformément à nos attentes.
Ces résultats prouvent que le concept de digestion ciblée de l’ADNmt par une MN est acquis, permettant une manipulation spécifique de la séquence de l’ADN mt.
Nous sommes actuellement en train de construire une lignée cellulaire exprimant d’une manière conditionnelle la MN, puis sélectionnerons des clones résistant à l’effet de cette enzyme. Cette deuxième étape acquise, nous construirons la souris présentant cette mutation sur l’ADNmt, modèle d’une pathologie humaine.

Cette approche technologique devrait permettre de corriger une mutation pathogène humaine mitochondriale pour traiter par thérapie génique ciblée l’ADNmt.

Un autre intérêt majeur de cette technique consiste dans le fait qu’elle n’est pas restreinte à la souris et peut s’appliquer à n’importe quelle espèce animale, voire végétale. En cas de succès de la seconde étape nous envisagerons conjointement avec la société Cellectis un brevet d’application des MN pour la manipulation du génome des organites.

Aucune.
Accord de collaboration avec Cellectis, régi par INSERM-transfert.

Manipuler le génome des organismes est d'une importance cruciale pour l'étude du développement, de mécanismes physiologiques, de maladies héréditaires et de la génétique. À ce jour, parmi tous les mammifères, seule une seule espèce, Mus musculus, autorise des modifications ciblées de son génome nucléaire par recombinaison de l'ADN chromosomique. Mais tous les eucaryotes incluent un deuxième génome à hérédité maternelle, situé dans les mitochondries, qui est responsable de nombreuses pathologies et de susceptibilités à d’importantes maladies comme le cancer, le diabète et les maladies d'Alzheimer et de Parkinson. Malheureusement, en raison du nombre élevé de copies par cellule, la manipulation de l'ADN mitochondrial (ADNmt) a été systématiquement confrontée à une limite technologique, empêchant la génération de modèles animaux avec des mutations de l'ADNmt reproduisant celles identifiées chez l’homme.

Nous proposons ici de développer une technique pour générer « à façon » des lignées cellulaires avec un ADNmt muté. Le concept implique l'expression dans les mitochondries d’enzymes de restriction de type méganucléases, qui ont été conçues pour reconnaitre une séquence cible spécifique de l'ADN mitochondrial. Ces méganucléases devraient contre-sélectionner les copies sauvages de ce génome et permettre la sélection et l'amplification de rares exemplaires d'ADNmt mutés sur le site de restriction reconnu par l'enzyme. A partir des clones recueillis par cette approche, la technique requise pour produire l'animal trans-mitochondrial correspondant avec l'ADNmt muté a été largement décrite dans la littérature.

Nous avons conçu et obtenu deux méganucléases permettant de digérer l'ADNmt de souris à des sites correspondant à des nucléotides mutés responsables chez l’homme du Syndrome de Leigh et de la Neuropathie Optique Héréditaire de Leber. Notre projet consiste à générer les deux modèles de souris pour ces maladies. Si effectif, notre développement expérimental permettra de générer – et d'étudier en aval – des modèles animaux avec l’ADNmt muté, sans restriction d’espèce, une technique qui pourrait également s'appliquer aux génomes des organites des plantes.