Analyse Quantitative Ultrarapide par RMN 2D pour l'élucidation de métabolismes complexes – QUANTUM

En 2002, une méthode prometteuse a été proposée par le Pr. Lucio Frydman, un chercheur israélien renommé, permettant de réaliser pour la première fois une expérience de RMN 2D en une fraction de seconde. Nous avons mis en place cette méthodologie dite « ultrarapide » au laboratoire CEISAM. Nous avons proposé plusieurs développements novateurs afin de rendre la RMN 2D ultrarapide applicable à l’analyse quantitative de mélanges complexes, élargissant ainsi le champ d’applications de cette nouvelle technique. A partir de cette expérience, le projet QUANTUM a permis de développer une méthodologie analytique complète pour rendre la RMN 2D ultrarapide utilisable pour l’analyse quantitative de mélanges métaboliques complexes. Ce projet repose sur des développements méthodologiques originaux et novateurs. Ces méthodes optimisées ont fait l’objet d’une validation analytique complète, afin de les rendre applicables à l’étude quantitative d’échantillons réels tels que des extraits de cultures cellulaires cancéreuses.

Nos développements méthodologiques ont permis de rendre nos méthodes ultrarapides accessibles à une large communauté internationale. Les premières applications quantitatives de la RMN 2D ultrarapide ont permis de mesurer, avec une précision inégalée, la concentration des principaux métabolites dans des extraits biologiques (extraits cellulaires cancéreux, extraits végétaux…). Enfin, le projet QUANTUM a permis un véritable essor de la RMN ultrarapide, donnant naissance à de nombreuses collaborations et projets, ainsi qu’à la nomination du porteur à l’Institut Universitaire de France.

Bien que le succès du projet QUANTUM soit incontestable, les résultats obtenus ont également mis en avant de nouveaux verrous méthodologiques, qu’il sera nécessaire de lever afin de pouvoir considérer de nouvelles applications des méthodes ultrarapides :
• L’application de la RMN ultrarapide quantitative à l’analyse isotopique –spécialité de l’équipe depuis près de 40 ans– est incontestablement l’objectif majeur de nos travaux à venir. Des premiers résultats prometteurs en milieu enrichi ont été obtenus au cours du projet QUANTUM. Toutefois, l’application de la RMN ultrarapide à l’abondance naturelle nécessitera d’améliorer la précision d’un ordre de grandeur (de 1% à 0,1%) afin qu’elle soit compatible avec la gamme de déviations isotopiques du 13C. Cela nécessitera de nouveaux développements méthodologiques, qui permettront l’application de ces méthodes à des fins d’authentification et de contrôle.
• L’application de la RMN ultrarapide à la métabolomique, dont l’intérêt a été démontré dans le cadre du projet QUANTUM, est encore limitée par l’ordre de grandeur des concentrations accessibles. Les applications réalisées dans ce projet permettent de cibler une dizaine de métabolites majeurs, mais elles bénéficieraient grandement d’une amélioration significative de sensibilité. Une piste prometteuse consisterait à coupler la RMN quantitative aux techniques d’hyperpolarisation. Des premiers résultats prometteurs ont été obtenus en ce sens.

Les résultats du projet ont déjà donné lieu à 25 publications dans des revues internationales à comité de lecture et 1 chapitre de livre, et plusieurs autres devraient suivre. Ils ont également été présentés à la communauté scientifique lors de nombreux congrès nationaux et internationaux, faisant l’objet de 71 communications au niveau international (42) et national (27), incluant 24 conférences invitées. La liste complète de cette production scientifique est disponible sur le site internet du porteur : www.univ-nantes.fr/giraudeau-p

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est un outil analytique extrêmement puissant, employé dans de nombreux domaines tels que l’élucidation de structures organiques, la biochimie, l’analyse pharmaceutique ou la spectroscopie in vivo. Cependant, la RMN souffre d’importantes limitations dues aux recouvrements entre les pics, en particulier dans le cas de mélanges complexes de métabolites. Par conséquent, la RMN 1D est peu adaptée à la quantification précise de biomarqueurs dans les échantillons complexes. La RMN 2D, en revanche, permet de s’affranchir de cette limitation grâce à l’étalement des pics dans une dimension supplémentaire, et offre donc un important potentiel pour mesurer simultanément et sans ambiguïté la concentration d’un grand nombre de métabolites. Cependant, la RMN 2D reste peu utilisée pour l’analyse quantitative, tout d’abord car une procédure de calibration est nécessaire à cause de la nature multi-impulsionnelle des séquences de RMN 2D, et surtout à cause du temps nécessaire à la réalisation d’une telle calibration, en raison de la nature « multi-scan » des expériences de RMN 2D.
Heureusement, une méthode émergente et prometteuse a été proposée en 2002 par le Pr. Lucio Frydman, permettant l’acquisition d’un spectre de RMN 2D en une fraction de seconde. Cette méthode, dite « ultrarapide », repose sur l’acquisition de l’ensemble des données en un seul scan. Très récemment, nous avons mis en place avec succès cette méthodologie au laboratoire CEISAM. Nous avons proposé plusieurs développements méthodologiques novateurs afin de rendre la RMN 2D ultrarapide applicable à l’analyse quantitative de mélanges, élargissant ainsi le champ d’applications de cette méthode prometteuse.
A partir de cette expérience, le but du projet QUANTUM est de développer une méthodologie analytique complète pour rendre la RMN 2D ultrarapide utilisable en routine pour l’analyse quantitative de mélanges métaboliques complexes. Ce projet repose sur des développements méthodologiques originaux, centrés sur l’optimisation de la résolution et de la sensibilité des méthodes ultrarapides. Ces méthodes optimisées feront l’objet d’une validation analytique complète, afin de les rendre applicables à l’étude quantitative d’échantillons réels tels que des extraits de cultures cellulaires cancéreuses. Au terme de ce projet, nous proposerons un ensemble d’outils utilisables en routine, incluant la stratégie analytique, les séquences d’impulsions, et les programmes de pré-acquisition et de traitement pour l’analyse quantitative par RMN 2D ultrarapide. Ces outils seront mis à disposition de la communauté académique via internet.
Notre implication dans le développement de la RMN 2D ultrarapide est un axe de recherche émergent au sein de notre groupe, dont l’expertise se situe essentiellement autour de l’analyse isotopique appliquée à l’authentification de produits d’origine naturelle ou l’élucidation de voies métaboliques. Cependant, bien que nos premiers travaux sur ce sujet datent seulement de 2007, nous sommes devenus en trois ans le second groupe de recherche au monde (le premier en Europe) par le nombre de publications portant sur la RMN 2D ultrarapide. De plus, nous avons publié la seule étude connue concernant l’application de la RMN 2D ultrarapide à l’analyse quantitative. Grâce à cette expérience, et afin d’élargir la diffusion des méthodes ultrarapides, nous souhaitons rendre ces dernières accessible en routine à un maximum de chercheurs, en développant des programmes adaptés et intégrés aux logiciels commerciaux existants, et en les mettant à disposition de la communauté scientifique.
Enfin, le projet QUANTUM constitue une opportunité de développer des méthodes rapides de RMN 2D quantitative appliquées aux études métabolomiques, ce qui constitue une approche nouvelle au sein du laboratoire CEISAM. Ce projet devrait ouvrir de nouvelles perspectives d’applications et enrichir le champ d’expertise de notre laboratoire.