Biomarqueurs de génotoxicité ex vivo et in vivo. – GENOTOXTRACK

Les substances génotoxiques induisent des dommages à l'ADN. Parmi ces dommages, les cassures double-brin (CDB) peuvent aboutir à la mort cellulaire et, si elles sont mal réparées, générer des translocations et de l’instabilité génétique.
La phosphorylation de l’histone H2AX à son extrémité C-terminale, gH2AX, est un marqueur utilisé pour étudier les CDB et suivre la réparation de l’ADN. Cependant, la détection de gH2AX dépend de l’utilisation d’anticorps sur des cellules fixées. Nous proposons ici de développer des biomarqueurs pour détecter et suivre les CDB et leur réparation dans des cellules vivantes, ex vivo, et dans des animaux modèles alternatifs, in vivo.
Comme preuve-de-concept, des nanobodies dirigés contre gH2AX seront développés mais nous développerons également d'autres biomarqueurs des cassures et/ou réparation de l'ADN. En plus des anticorps conventionnels, les lamas produisent des anticorps constitués uniquement de chaines lourdes, dont le site de liaison à l’antigène est formé d’un unique domaine (VHH ou nanobody). Après immunisation, une banque VHH sera construite et criblée par phage-display. Les nanobodies liant la cible (gH2AX) seront isolés et leur séquence sous-clonée dans un vecteur mammifère, en fusion avec une étiquette fluorescente. Chaque fluobody sera alors testé en cellules humaines et plusieurs paramètres seront analysés (formation de foci, amplification/disparition du signal, bruit-de-fond fluorescent) pour valider les biomarqueurs.
A cette étape du programme, nous développerons la technologie FRET afin d'améliorer le signal et suivre simultanément deux marqueurs. En particulier, de nouveaux marqueurs de la réparation ou de l'apoptose, présentés par l'histone H2AX, ont récemment été décrits dans les cellules humaines. Nous testerons des associations de marqueurs afin de différencier spécifiquement l’un ou l’autre de ces processus et de suivre le devenir des cellules. Les biomarqueurs qui permettront de suivre en temps réel les stress génotoxiques et les CDB in vivo, ainsi que leurs utilisations, seront brevetés.
Une application directe de nos outils sera l'analyse des génotoxines, produites par les bactéries de type E. coli -pathogènes ou non. Ces génotoxines induisent des défauts dans le cycle cellulaire et des CDB dans les cellules hôtes. Nous étudierons les méchanismes générant les CDB afin de définir de nouvelles cibles pour nos biomarqueurs et nous utiliserons nos outils afin de cribler les souches bactériennes et de tester leur éventuelle génotoxicité. Nous étudierons en particulier les mécanismes de réparation mis en place dans différents contextes (dose de génotoxiques, temps d’exposition, mutations/knocked-down de certaines voies), une dérégulation de ces processus pouvant conduire à l'instabilité génomique.
Enfin, nous prévoyons le transfert de nos outils dans des animaux modèles alternatifs -tels que zebrafish et le nématode- afin de suivre la présence de génotoxiques et la pollution des eaux et/ou des sols.
Globalement, ce projet permettra de développer les outils pour déterminer la toxicité de substances, connues ou nouvelles, et de suivre les stress génotoxiques directement dans les cellules, ex vivo ou in vivo. Il permettra également d’analyser le devenir des cellules exposées et de prédire des processus induisant l’instabilité génétique. Enfin, nos outils devraient nous permettre de mieux comprendre ces mécanismes fondamentaux et être utilisés dans la prévention et/ou le diagnostic d’exposition à des génotoxiques, d’améliorer la protection de notre environnement et la santé humaine.