Reconnaissance d’homologie et échange de brin d’ADN catalysés par RAD51: ordre et dynamique des monomères de RAD51 au sein de filaments et pendant l’interaction du filament avec une molécule d’ADN duplex. – RADORDER

La recombinaison homologue est un processus universel de la vie, essentiel au maintien de l’intégrité génomique, à la survie cellulaire et à la protection contre la tumorigenèse. La duplication fidèle du génome, la ségrégation des chromosomes et la réparation des cassures double brin de l’ADN dépendent de la capacité des cellules à effectuer des réactions d’échanges de brin d’ADN entre molécules d’ADN homologues

Le cœur catalytique de la recombinaison homologue réside dans une structure moléculaire complexe, formée par une recombinase dépendante de l’ATP, polymerisée en une hélice dextrogyre autour d’un brin d’ADN simple brin. Malgré plusieurs décennies d’études de la recombinase prototype RecA de bactérie, les mécanismes de reconnaissance d’homologie dans une molécule d’ADN duplex et d’échange de brin d’ADN, restent mal compris.

La raison principale qui a rendu ces études réfractaires à l’expérimentation et à l’interprétation est que l’on n’a pas été capable de sonder la dynamique conformationelle des monomères de la recombinase et du substrat ADN dans ces filaments. Les réactions asynchrones, l’hétérogénéité structurelle et les mesures portant sur le comportement moyen des molécules d’une population ont empêché l’étude précise et quantitative de la dynamique conformationelle des filaments par la voie de la biochimie d’ensemble conventionnelle.

Pour ces raisons, plusieurs groupes de recherches se sont lancés dans l’analyse de la dynamique conformationelle des filaments par les méthodes de manipulation de « molécules uniques » ou plus correctement parlé d’analyse de réaction sur molécule d’ADN unique. Deux écoles ont émergé. La première école utilise des pinces magnétiques pour manipuler des molécules d’ADN uniques en utilisant la surface de la chambre de flux comme point d’ancrage d’une des extrémités de la molécule d’ADN, et une microsphère magnétique, dont la position et la rotation peuvent être contrôlées avec grande précision, pour attacher la seconde extrémité de la molécule d’ADN. Cette instrumentation permet de mesurer des variations de longueur, de torque et de tension exercés sur la molécule d’ADN lorsqu’elle interagit avec une protéine mais sans visualisation directe de la protéine pendant la réaction. Au contraire, l’autre école visualise directement la protéine marquée par fluorescence ( et parfois aussi l’ADN) durant son interaction avec un molécule unique d’ADN maintenue et manipulée à l’aide de pinces optiques dans une chambre microfluidique ; ou bien attchée via une extrémité sur la surface de la chambre et étirée par un flux. Par microscopie à fluorescence à champ large ou par microscopie TIRF (lorsque la molécule d’ADN est attchée à la surface et étirée par un flux) le comportement dynamique de la protéine marquée par fluorescence est directement visualisé en temps réel en utilisant un e caméra EM-CCD ultra-sensible et rapide. Les pinces optiques permettent également de combiner des mesures de la force exercée sur la molécule d’ADN.

Nous proposons ici de directement visualiser la dynamique conformationelle du filament nucléoprotéique de la recombinase RAD51 humaine en utilisant l’approche de la seconde école, mais, avec en y combinant l’imagerie de polarisation-anisotropie de fluorescence de façon à obtenir des informations nouvelles sur le processus de reconnaissance d’homologie et d’échange de brin d’ADN pendant la recombinaison homologue catalysée par les recombinases dépendantes de l’ATP.