Signalisation transmembranaire des récepteurs métabotropiques du glutamate – mGluNano

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) appartiennent à la Classe C des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Ils sont activés par le glutamate, le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central. Les 8 récepteurs mGlu (mGluR1 à mGluR8) sont exprimés dans des régions différentes du cerveau, et ils constituent des cibles pharmacologiques pour le traitement de différents troubles neurologiques et psychiatriques (épilepsie d?absence, anxiété, dépression, migraine, spasmes, maladie de Parkinson et douleur). Les mGluR sont des homodimères allostériques à multiples domaines composés d?un domaine Vénus flytrap (VFT) qui lie les agonistes orthostériques tel que le glutamate, et les antagonistes compétitifs, et d?un domaine à sept hélices transmembranaires (7TM) commun à tous les GPCR et responsable de l?activation de la protéine G. De façon intéressante, des modulateurs allostériques (AM) positifs peuvent agir directement dans les 7TM pour moduler l?activation des mGluRs. Ces molécules sont sensés être de meilleures drogues que les agonistes classiques puisqu?elles potentialisent l?activité du récepteur uniquement quand et où l?agoniste naturel est présent. Les régulateurs allostériques négatifs bloquent l?activation des protéines G par le récepteur. Un défi majeur dans la pharmacologie des mGluR est de comprendre les bases moléculaires de ces AM, et d?étudier comment les changements de conformations des 7TM sont responsables de l?activation de la protéine G. L?objectif de notre projet est de cartographier les changements conformationnels dans les 7TM induits par un AM positif ou négatif en utilisant une combinaison de techniques biochimiques et biophysiques. Nous proposons pour la première fois : (i) de purifier les 7TM des mGluR ; (ii) de reconstituer les 7TM purifiés comme monomères ou dimères dans des nanodiscs phospholipidiques ; (iii) de marquer ces monomères et dimères à des sites spécifiques à l?aide de trois fluorophores différents et compatibles avec des mesures de FRET en temps résolu ; (iv) de déterminer les changements conformationnels dans les 7TM induits par la liaison des ligands. Nous utiliserons les récepteurs mGluR2 et mGluR5 comme modèles. Les nanodiscs (diamètre de 100 Å) miment l?environnement naturel des récepteurs, et ils permettent de contrôler strictement la stoéchiométrie des 7TM, un ou deux monomères par nanodiscs. Nos résultats préliminaires montrent que les 7TM purifiés de mGluR2 reconstitués dans des nanodiscs sous forme de monomères ou de dimères, activent efficacement la protéine G. Pour cartographier dans les nanodiscs les changements conformationnels induits par les AM et de l?ordre de l?Ångström, nous développerons une approche innovante de double FRET en temps résolu basé sur le marquage orthogonal avec trois fluorophores compatibles avec le FRET en temps résolu (cryptate de terbium comme donneur, et fluorescéine et Alexa647 comme accepteurs). Ce projet sera développé par trois partenaires : Drs P. Rondard et S. Granier (Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier) pour la purification des 7TM, la biochimie et l'analyse biophysique ; Dr. JL Banères (Montpellier) pour le développement des nanodiscs et l?analyse biophysique ; CisBio pour le développement d?outils chimiques pour le FRET. En résumé, ce projet interdisciplinaire nécessite des expertises en chimie, photophysique, biochimie et biophysique. Nous espérons obtenir une vision structurale des bases moléculaires de l?activation des 7TM de mGluRs. Ces résultats devraient permettre le développement de meilleurs modulateurs allostériques par une conception rationnelle de drogues basée sur des données structurales.