JCJC - Jeunes chercheuses et jeunes chercheurs

Exploration de la diversité fonctionnelle au sein d’une famille de métalloprotéines basée sur un repliement de type DSBH – CUPA

Résumé de soumission

Les Cupines constituent une vaste famille de protéines aux fonctions biochimiques très diverses et nommée d?après un coeur formé par huit brins Béta à l?allure de tonneau (repliement DSBH, Double-Stranded Beta Helix). Ce coeur, d?une grande stabilité, contient le site actif et dans la plupart des cas un ion métallique. La sphère de coordination classique dans les cupines dites de type « germine » est composée de 3-His, 1-Glu. Cependant, le plus grand sous groupe des cupines regroupe les oxygénases dépendantes du 2-oxoglutarate (2-OG oxygénases), enzymes fixant un ion Fe(II) par une triade faciale de 2-His, 1-Asp/Glu et qui utilisent le 2-OG comme cofacteur pour réaliser l?oxydation d?un grand nombre de substrats divers. De nombreuses études biochimiques indiquent que la modification d?un nombre limité de résidus aminoacides (résidus plastiques) peut modifier de façon significative la fonction d?une protéine, appuyant ainsi la notion d?évolution divergente au sein des familles de protéines. Le but de ce projet est de comprendre les paramètres qui gouvernent l?activité d?un ion métallique au sein d?un motif structural conservé, plus particulièrement, le repliement DSBH. Nous avons ainsi choisi une enzyme modèle pour laquelle des informations structurales et fonctionnelles sont disponibles : l?anthocyanidine synthase (ANS), une 2-OG oxygénase typique. À partir de ce système, nous souhaitons déterminer les modifications minimales nécessaires pour induire de nouvelles activités. Rediriger la fonction d?une protéine, ou transplanter l?activité d?une protéine à une autre, constituent des défis majeurs. Il existe cependant quelques beaux exemples dans la littérature. Dans la majorité des cas, des variations mineures au site actif se sont avérées suffisantes pour induire une nouvelle activité. Parmi ces exemples, relativement peu concernent les métalloenzymes, et encore moins, celles qui ne contiennent pas de centre hémique. Dans le cas de la superfamille des cupines, la diversité de fonctions biochimiques peut provenir de modifications mineures de résidus au site actif, mais également, de la nature de l?ion métallique et de la présence ou non d?un cofacteur additionnel (2-OG par exemple). Cette famille nous fournit donc une très grande versatilité qui, au-delà du défi qui en résulte, débouche sur une quasi-infinité de possibilités. Partant de l?ANS nous avons choisi de cibler l?activité d?un ensemble de protéines représentatives de la diversité au sein de la famille. En travail préliminaire, des alignements de séquences et des superpositions de structures ont été effectuées afin de déterminer les éventuels résidus plastiques à modifier. Nos choix ont été guidés par les trois points suivants. 1) Le premier point concerne l?influence de la topologie du site actif et de la sphère de coordination. Ainsi nous souhaitons recréer une sphère de coordination de type 2-His similaire à celle des halogénases 2-OG dépendantes récemment identifiées telles que SyrB2. Dans cette dernière, l?ion Fe(II) est lié à deux histidines et la position laissée vacante par Asp est occupée par un halogène ensuite incorporé au substrat. Nous ciblerons ainsi une activité halogénase. Nous souhaitons également créer une sphère de coordination de type 3-His et cibler l?activité de la cystéine dioxygénase (CDO). Enfin, nous souhaitons créer une sphère de type germine i.e. 3-His, 1-Glu. Les systèmes enzymatiques visés dans ce cas sont la quercétinase (QUER), ou l?Oxalate oxidase (OXO). Dans le cas particulier de l?activité de type QUER, de la mutagenèse aléatoire est envisagée pour dépasser un éventuel problème lié au positionnement du substrat dans la cavité. 2) Le deuxième point concerne la dépendance en cofacteur 2-OG. En nous basant sur les similitudes entre l?ANS et l?oxydase de l?acide 1-aminocyclopropane carboxylique (ACCO), nous envisageons avec quelques mutations éventuelles, de cibler une activité ACCO. 3) Le troisième point concerne l?influence de la nature du métal au site actif et les mutants préparés seront analysés en présence de divers ions métalliques. En conclusion, nous sommes conscients qu?avec des mutations ponctuelles nous avons peu de chances de générer des mutants ayant une activité optimale et cela ne constitute pas notre but principal. Avec un nombre limité d?activités cibles et de positions identifiées à muter, nous recherchons les paramètres qui déterminent la réactivité dans le but de les comprendre et à plus longue échéance de les contrôler.

Coordination du projet

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

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Début et durée du projet scientifique : - 0 Mois

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