JCJC - Jeunes chercheuses et jeunes chercheurs

Nouvelles sondes glycolipidiques pour l'imagerie membranaire – CARBOHYDRPROBES

Synthèse et étude de sondes glycosylées pour l’imagerie membranaire

Ce programme vise le développement de nouvelles sondes optiques classique et non-linéaire capables de s’insérer efficacement dans les membranes plasmique de cellules eukariotes et de constituer de bons reporteurs d’évènements se produisant à la surface de ces membranes

Développement de sondes nouvelles optiques pour la microscopie combinée GSH-TPEF.

La microscopie par génération de second harmonique (GSH) combinée à la microscopie par fluorescence excitée à deux photons (TPEF) constituerait un outil de choix pour l’imagerie optique du potentiel de membrane, en particulier pour l’imagerie de variation du potentiel de membrane de réseaux de neurones, problème fondamental en neuroscience. Ce type d’imagerie serait un outil formidable pour la compréhension des phénomènes de communication entre cellules, en particulier de cellules neuronales, impliqués dans de nombreuses pathologies, notamment du système nerveux. A l’heure actuelle, seule une démonstration de principe a été réalisée, faute de sonde optique adaptée. L’enjeu principal est donc bien le développement de sonde optique pouvant servir à ce type d’imagerie.<br /><br />L’objectif de ce projet était de concevoir de nouveaux colorants construit sur un motif sucre pour l’imagerie combinée GSH-TPEF de membrane cellulaire. Le principal problème qui se pose, est d’obtenir des molécules ayant les bonnes propriétés optiques, une solubilité dans les milieux biologiques suffisantes pour pouvoir être utilisé sans problème en routine par les biologistes, et présentant une très bonne affinité pour la membrane cellulaire.

Obtenir des composés solubles dans les milieux biologiques (milieux aqueux) et présentant une très bonne affinité pour la membrane cellulaire (milieu lipophile) est un vrai défi car les deux requis sont contradictoires. Pour répondre à ce problème, nous avons choisi de nous intéresser à des molécules amphiphiles, c'est-à-dire possédant à la fois une partie hydrophobe (en l’occurrence le colorant responsables des propriétés optiques) et une partie hydrophile. Pour cette dernière, nous nous sommes focalisés sur des motifs « sucres », facile d’accès, et dont la structure peut aisément être changée pour moduler les propriétés physico-chimique des molécules finales. Ainsi, deux familles de colorants ont été envisagées afin de varier au mieux les propriétés de solubilité dans l’eau et de marquage de membrane.
Les molécules ont été synthétisées au Laboratoire de chimie organique de L’INSA de Lyon, grâce au recrutement d’un post-doctorant pour une période de 24 mois. Les propriétés de marquages de membranes ont été étudiées sur des membranes modèles, puis sur un modèle biologique (des cellules de muscles striés), au Laboratoire de Génie Enzymatique, Membranes Biomimétiques et Assemblages Supramoléculaires à Lyon et en collaboration avec S. Pouvreau du Laboratoire Physiologie Intégrative, Cellulaire et Moléculaire à l’Université de Lyon. Les propriétés optiques et microscopiques des molécules synthétisées ont été étudiées au laboratoire de chimie de l’ENS de Lyon, ainsi qu’en collaboration avec l’équipe du Pr. K. Kamada à Osaka au Japon. Enfin, l’imagerie combinée GSH-TPEF a été réalisée en collaboration avec l’équipe du Pr. K. Clays de la Katholieke Universiteit Leuven en Belgique.

Nous avons donc synthétisé des molécules amphiphiles, solubles dans l’eau, mais suffisamment hydrophobes pour pouvoir marquer la membrane cellulaire. La solubilité est apportée par un motif « sucre » greffé sur le colorant (partie responsable des propriétés optiques, mais également partie lipophile de la molécule). Sur un colorant choisi pour ses propriétés optiques adaptées (longueur d’onde d’absorption, longueur d’onde et efficacité d’émission, propriété de génération de second-harmonique), plusieurs motifs sucre différents ont été greffé grâce à l’optimisation de la réaction de couplage.
Après obtention des différents colorants, leurs propriétés optiques, ainsi que leurs propriétés d’insertion dans des membranes modèles ont été étudiées. Trois molécules présentent d’exceptionnelles propriétés de marquage de membrane. Les colorants ont ensuite été testés en imagerie cellulaire sur de cellules de muscles striés de souris, et comparés avec des sondes commerciales les plus utilisées pour l’imagerie de membrane par fluorescence. Avec ces nouveaux composés, un marquage des membranes bien meilleur et bien plus stable dans le temps a été obtenu. Les nouveaux colorants synthétisés sont également beaucoup moins toxiques et photo-toxiques que les marqueurs commerciaux et présentent une stabilité photo-chimique meilleure. Enfin des essais de microscopie combinée ont été réalisés avec succès sur cellule HeLa, grâce à une nouvelle collaboration avec l’équipe du Pr. K. Clays de l’université de Leuven en Belgique. Un programme d’échange de chercheur a été obtenu en 2012. D’autres collaborations fructueuses ont également été développées, notamment avec le Pr. K. Kamada d’Osaka au Japon et les équipes de J. Lemoine et P. Dugourd à Lyon. Une ANR a été obtenue en 2012 avec ces équipes.

Les premières images de microscopie combinée GSH-TPEF ont été obtenues avec les molécules les plus prometteuses. Un très bon marquage membranaire et un très bon signal de GSH ont été obtenus, stables dans le temps, ce qui est très encourageant. Pour une application pratique, il reste néanmoins à vérifier que ce signal de GSH peut mesurer une variation de potentiel de membrane. Des essais sur d’autres types cellulaires, notamment des neurones sont également indispensables pour valider la méthode et ces nouvelles sondes. Enfin, même si le marquage obtenu est meilleur qu’avec les molécules utilisées actuellement, il faut encore optimiser les propriétés des molécules pour avoir un marquage plus stable dans le temps. L’expérience acquise lors de ce projet, ainsi que les nouvelles collaborations mises en place, notamment avec l’équipe de K. Clays, spécialisée dans la microscopie combinée GSH-TPEF devrait permettre d’accéder rapidement à la prochaine génération de sonde.

J. Phys. Chem. B 2012, 116 (2), 841-851. Q. Enjalbert, A. Racaud, J. Lemoine, S. Redon, M. M. Ayhan, C. Andraud, S. Chambert, Y. Bretonniere, C. Loison, R. Antoine and P. Dugourd. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2011, 25 (22), 3375-3381. Q. Enjalbert, R. Simon, A. Salvador, R. Antoine, S. Redon, M. M. Ayhan, F. Darbour, S. Chambert, Y. Bretonnière, P. Dugourd and J. Lemoine : deux articles résultant d’une collaboration avec les équipes de J. Lemoine et P. Dugourd de Lyon initiée lors du contrat ANR et grâce aux molécules développées lors de ce contrat.
Article soumis à Bioconj Chem en nov 2013. Sébastien Redon, Julien Massin, Sandrine Pouvreau, Evelien De Meulenaere, Koen Clays, Yves Queneau, Chantal Andraud, Agnès Girard-Egrot, Yann Bretonnière, and Stéphane Chambert. Présentant les résultats principaux obtenus lors de ce contrat.

Brevet (impliquant un seul partenaire). Mass spectrometry quantification method. J. Lemoine, P. Dugourd, A. Salvador, R. Antoine and Y. Bretonnière.PCT Int. Appl. (2012), WO 2012066261 A1 20120524.

Le but de ce projet est d?utiliser de nouveaux motifs saccharidiques dans la conception de sondes spécifiques pour l'imagerie membranaire par microscopie par génération de second harmonique. Cette technique d?imagerie non linéraire s?est révélée particulièrement adaptée pour l'imagerie des membranes cellulaires car elle permet d'imager spécifiquement les interfaces membranaires sans aucun signal des liquides environnants et présente une exceptionnelle sensibilité aux variations du potentiel de membrane. Les molécules employées jusqu?à présent ont permis de montrer la faisabilité et l'énorme potentiel de l'imagerie non linéaire, mais ne sont absolument pas optimisées pour une application pratique de cette technique. De nombreux motifs oligosaccharidiques sont présents au niveau des membranes cellulaires, notamment comme constituants des têtes polaires de certains phospholipides ou à la surface de protéines transmembranaires. En greffant des sucres sur des chromophores non linéaires répondant aux critères physiques pour la microscopie par génération de second harmonique, nous pensons obtenir des molécules amphiphiles présentant une bonne affinité pour la membrane cellulaire et une solubilité aqueuse suffisante pour une utilisation en biologie. L?insertion des sondes synthétisées dans des monocouches de phospholipides sera étudiée par de pression de surface sur couche de Langmuir et de microscopie de diffusion à l?angle de Brewster. Une collaboration avec une équipe de physicien spécialisée dans l?imagerie non linéaire sur cellule permettra de valider les molécules sondes obtenues par des études d?imagerie non linéaire sur cellules vivantes. Ce projet nettement pluridisciplinaire implique trois partenaires, deux chimistes de synthèses spécialisés en chimie des sucres (porteur du projet) et dans la conception de chromophores non linéaires ainsi qu?un biochimiste qui sera responsable des études sur couche de Langmuir. L?approche développée ici repose sur l?utilisation de deux réactions de « click » ; la réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire d?un azoture sur un alcyne terminal, catalysée par l?ion cuivre I et la réaction thiol-ène entre un sulfydrile et un alcène. Pour ce faire, nous développerons des méthodes efficaces de synthèses régiosélectives de sucres azidés sur différentes positions en utilisant les conditions de réaction de Mitsonobu et l?acide hydrazoique (HN3). Nous étendrons ensuite cette synthèse à des motifs oligosaccharidiques plus complexes, ce qui devrait donner accès à différents squelettes polyhydroxylés sur lesquels seront « cliqués » des chromophores possédant des propriétés d?optique non linéaires adéquates et qui auront été fonctionnalisés avec des groupes alcynes terminaux. Dans un deuxième temps, l?utilisation de l?acide thiolacétique ou de nucléophiles soufrés sur des sucres préalablement fonctionalisés devraient conduire à des sucres possédant une fonction thiol voire à des motifs plus complexes bi-fonctionnels orthogonaux thiol et azido. Le couplage d?un chromophore possédant une fonction alcyne par une première réaction de « click » (cycloaddition) suivie d?une seconde réaction de « click » (ène-thiol) donnera accès à des sondes de seconde génération dans lesquelles la balance hydrophilie / lipophilie pourra être varier à façon selon le second groupe introduit. Grâce à la réaction thiol-ène et à l?emploi de sucres mono-azidé mais poly-allylés combinés à des sucres soufrés, il devient possible d?accéder à des plates-formes polysaccharidiques multifonctionnelles qui pourront être utilisées par la suite pour des synthèses plus complexes ou de nouveaux « cliquées » sur un chromophore non linéaire portant une fonction alcyne. Dans le même temps, des études plus fondamentales sur des nouveaux motifs thioglycosides comme donneurs de glycosyle seront menées. Ce travail devrait déboucher sur la synthèse d?antigène Tn et son greffage sur des plates-formes polyfonctionnelles précédemment obtenues. Ces objets sophistiqués seront tester in vitro pour valider une méthode de détection de reconnaissance à la surface cellulaire entre l?antigène Tn et l?anticorps par variation du signal de second harmonique de la sonde greffée. Avec ce projet ambitieux, qui sera mené en étroite collaboration des biophysiciens, et dans lequel nous apporterions notre expérience dans les domaines de la chimie de synthèse des sucres, de la chimie de synthèse de motifs non linéaires efficace et notre expertise en biochimie des surfaces, nous envisageons de participer au développement d'une imagerie non linéaire fonctionnelle de la membrane cellulaire sensible au potentiel de membrane.

Coordination du projet

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

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Début et durée du projet scientifique : - 0 Mois

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