– COORDACTIN

La migration cellulaire est essentielle dans de nombreux processus tels que le développement embryonnaire, la réponse immunitaire, la cicatrisation, et la formation de métastases. Elle implique les activités séquentielles de protrusion cellulaire (déformation de la membrane), formation de complexes focaux d?adhésion, de traction et de rétraction de l?arrière de la cellule. Tous ces processus sont engendrés par la réorganisation rapide du cytosquelette d?actine en réponse à des signaux extracellulaires. Les observations in vivo de cellules en mouvement ont montré la coexistence de structures très différentes de filaments d?actine : des réseaux branchés très denses dans le lamellipode (extension plate à l?avant de la cellule), des faisceaux parallèles dans les filopodes (extensions fines au bord avant du lamellipode), des filaments associés en fibres dans les complexes focaux d?adhésion? Comment la cellule peut coordonner toutes ces structures dynamiques spatialement et temporellement est une question cruciale toujours en suspens. Les études in vivo et in vitro du lamellipode et du filopode, qui sont situés dans une même région de la cellule, ont montré que les deux protrusions sont généreés par deux machineries distinctes qui induisent la polymérisation de filaments d?actine contre la membrane (WASP-Arp2/3 induit la formation d?un réseau branché dans le lamellipode et les formines génèrent de longs filaments uniques dans les filopodes). Si les deux systèmes sont maintenant assez bien élucidés individuellement, il reste à comprendre comment ils sont contrôlés de manière concertée à la membrane. Nous proposons dans ce projet de combiner les deux réseaux de filaments d?actine sur des membranes et d?étudier comment les propriétés de la membrane participent à la régulation et à coordination des deux réseaux d?actine. Pour cela, nous étudierons d?abord chaque système indépendamment pour comprendre le rôle exact de la membrane dans la croissance et la répartition des structures d?actine à la surface, avant de les associer. Nous observerons la diffusion des activateurs qui induisent la polymérisation des filaments d?actine à la membrane, et déterminerons ce qui peut la modifier lors de la croissance d?une structure d?actine. L?ancrage du réseau branché sur des membranes a montré la nature transitoire du lien entre l?activateur N-WASP et le filament d?actine, via le complexe Arp2/3. Par des techniques de photoblanchiment (FRAP) et de spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) nous mesurerons précisément la diffusion de N-WASP à la surface afin de déterminer la durée de cette interaction. Nos résultats permettront d?améliorer le modèle moléculaire du mécanisme de branchement. Dans le cas des formines, nous pensons que la fluidité de la membrane est importante. In vivo, elles sont regroupées au bout des filopodes pour nucléer des filaments d?actine parallèles. Nous déterminerons ce qui conditionne le regroupement des formines et permet d?obtenir des faisceaux de filaments, en variant les protéines régulatrices et les propriétés de la membrane. Nous essayerons également de trouver un jeu de conditions expérimentales pour lesquelles la membrane peut être déformée par les faisceaux d?actine, comme dans le cas des filopodes Dans la dernière étape, nous devrons d?abord définir les conditions biochimiques idéales pour que les deux machineries génèrent en parallèle les deux structures d?actine. Nous étudierons ensuite comment les deux réseaux se réorganisent mutuellement, en fonction de la composition du milieu et des propriétés membranaires. Pour cela, nous observerons simultanément, en microscopie à épifluorescence, la croissance des filaments d?actine (les 2 réseaux sont indiscernables) et la répartition des deux types d?activateurs. En particulier, nos observations devraient permettre de vérifier si les faisceaux parallèles apparaissent simultanément avec le réseau branché, ou s?ils sont générés ultérieurement par réarrangement des filaments branchés, comme suggéré par certains groupes. Nos résultats devraient aboutir à un modèle de la régulation/coordination concertée des machineries protrusives par les protéines régulatrices de l?assemblage de l?actine et par la membrane.