Etude sytématique du traffic golgien et role des proteins de la matrice – SecretGolgi

L'appareil de Golgi est l?organite central du trafic intracellulaire, actif à la jonction des voies de sécrétion et de trafic rétrograde. Son rôle est essentiel à la fois pour assurer les fonctions de ménage cellulaire et pour des fonctions fortement différenciées. La dynamique et les fonctions de l'appareil de Golgi ont été étudiées par de nombreux groupes depuis plus de 40 ans. Cependant, les mécanismes contrôlant le trafic antérograde et rétrograde dépendent de l?appareil de Golgi, les modes de régulation de la structure de cet organite et sa maintenance sont autant de questions aujourd?hui encore très débattues. Durant ces dernières années, nous avons accumulé des outils et des tests/modèles cellulaires que nous utiliserons dans ce projet afin de répondre aux questions suivantes dans le prolongement de nos travaux. Tout d'abord, nous allons continuer l'étude du rôle et de la dynamique de la Giantine, une protéine de la matrice de l'appareil de Golgi. Nous avons identifiés de nouveaux domaines fonctionnels de la Giantine, obtenus plusieurs anticorps recombinants originaux et récemment identifié des partenaires potentiels. L?étude fonctionnelle de la Giantine se fera en utilisant une approche de microscopie quantitative (FRAP, photo-conversion), des expériences d?inactivation de l?expression de cette protéine, accompagné par des approches de dé-localisation. Des tests d?interaction in vitro et in vivo seront aussi effectués avec les partenaires potentiels identifiés. Nous avons construit une protéine Giantine complète en fusion avec des protéines fluorescentes (GFP, mCherry) qui se comporte comme la protéine endogène. Par ailleurs, plusieurs mutants de troncation seront construits afin d'étudier le mode d?adressage de la Giantine vers les membranes golgiennes. Nous avons en effet montré que Giantine reconnaît un sous?ensemble des appareils de Golgi cellulaires. Nos données non publiées suggèrent en outre que plusieurs isoformes de Giantine existent dans la cellule et sont localisées sur des domaines différents de l'appareil de Golgi. Les mécanismes par lesquels se partitionnement se produit sont inconnus et seront étudiés ici. Dans une deuxième partie du projet, nous allons analyser directement la fonction de l'appareil de Golgi dans la sécrétion. Combien de routes existent au travers du labyrinthe golgien est inconnu, bien que des résultats récents indiquent que nous ne faisons que commencer à comprendre la complexité du trafic et de tri dépendants de l'appareil de Golgi. Pour avancer dans cette compréhension, nous utiliserons un test de trafic intracellulaire récemment mis au point dans le laboratoire. Ce test permet d'étudier et de quantifier transport de différents types de cargos appartenant à diverses classes de protéines (e.g. GPI, transmembranaires, solubles). Il est fondé sur la rétention sélective des rapporteurs dans un compartiment donneur et leur libération synchrone vers le compartiment suivant. La cinétique et le mode trafic de différents rapporteurs sera ainsi étudié à l'aide du même système. Après avoir développé plus avant le test, nous allons l'utiliser pour comparer la cinétique d?export depuis le réticulum endoplasmique et le tri golgien des rapporteurs choisis. Ce test est mis en ?uvre à la température physiologique et est potentiellement automatisable. Il permet aussi de perturber les cellules avant de libérer le rapporteur. Associé à des transfections systématiques par des collections de siRNA et à des procédés d?acquisition et d?analyse d?image automatisés, ceci permettra de construire des cartes fonctionnelles décrivant différentes routes de transport. Ce système pourrait aussi conduire à la découverte d'inhibiteurs spécifiques. Nous allons l?appliquer dans un premier temps à la caractérisation du trafic intracellulaire suivi par des enzymes golgiennes. Essentielles à la physiologie golgienne, leur mécanisme de transport vers l?appareil de Golgi est peu compris au niveau moléculaire. Enfin, ce test sera utilisé pour étudier, et perturber, le trafic de protéines potentiellement intéressantes d?un point de vue thérapeutique comme la E-Cadhérine et le TNF?. Des résultats récents, obtenus en étudiant ce couple de protéines, indiquent en effet qu'il devrait être possible d'interférer avec la sécrétion d'une sous-classe de protéine trans-membranaires exprimées à la membrane plasmique, sans affecter de façon systématique les voies de sécrétion cellulaire. Notre approche pourrait donc conduire à de nouvelles possibilités thérapeutiques. Certaines parties du projet reposent sur du criblage cellulaire et bénéficieront du fait que j'ai récemment co-installé une plate-forme de criblage à l'Institut Curie (BioPhenics). La réunion des outils que nous avons mis en place dans le laboratoire et des outils disponibles sur la plate-forme nous fournira une occasion unique d'étudier massivement les voies de sécrétion dépendant l'appareil de Golgi.