Carctérisation fonctionnelle et analyse génomique du complexe histone acétyl-transférase ATAC – GenomATAC

La transcription chez les eucaryotes est un processus très finement régulé faisant intervenir plusieurs étapes. L?accès de l?ARN polymérase II à des loci spécifiques et l?initiation précise de la transcription nécessite le recrutement de nombreux acteurs : les facteurs généraux de la transcription, des activateurs transcriptionnels spécifiques de gène et différents co-activateurs généralement caractérisés par une activité de modification de la chromatine. Les modifications post-traductionnelles des histones ont pu être liées au rôle de la chromatine dans l?activation ou la répression de la transcription. Une des modifications d?histones les plus étudiées est l?acétylation des extrémités N-terminales des histones. Les histones acétyltransférases (HAT) provoqueraient une décompaction de la chromatine qui augmente l?accessibilité à l?ADN des facteurs de transcription facilitant ainsi l?initiation de la transcription. Une des questions les plus stimulantes à propos de la transcription chez les eucaryotes est de comprendre comment les activateurs transmettent leur signal à la machinerie transcriptionnelle de base dans le contexte chromatinien caractérisé par une très forte condensation de l?ADN. Une autre question majeure à propos de la régulation transcriptionnelle est d?identifier les réseaux transcriptionnels permettant de maintenir la pluripotence des cellules souches embryonnaires et de comprendre leur régulation au cours des processus de différenciation cellulaire. Depuis leur identification, de nombreuses études ont été réalisées sur la structure, le rôle et la fonction des différents complexes HAT chez la levure. Cependant, on connait encore mal les fonctions de ces complexes chez les métazoaires et en particulier leurs rôles dans la maintenance de la pluripotence et dans la différentiation cellulaire. Ces dernières années, nos efforts se sont concentrés sur la caractérisation des complexes de type SAGA, contenant GCN5 ou PCAF chez l?homme. En même temps que d?autres groupes nous avons découvert un nouveau complexe HAT, appelé ATAC (pour Ada two a containing), contenant GCN5 ou PCAF. Nous proposons que la plus grande complexité des complexes HAT chez les métazoaires (e.g. complexes SAGA et ATAC) par rapport à la levure suggère fortement que cette diversité de complexes HAT permettrait des fonctions spécifiques aux métazoaires comme la maintenance de pluripotence des cellules souches et la différenciation cellulaire. Afin de mieux comprendre les fonctions des complexes HAT contenant GCN5 ou PCAF et pour commencer à répondre à ces deux questions, nous proposons dans ce projet : -de réaliser la caractérisation biochimique et cellulaire des complexes ATAC dans les cellules souches embryonnaires (ES) par une approche protéomique afin d?identifier a) la composition en sous-unités des complexes ATAC contenant soit GCN5 soit PCAF b) l?interactome des complexes ATAC dans les cellules ES c) les modifications post-traductionnelles des sous-unités identifiées. -d?identifier les sites de liaison du complexe ATAC sur le génome des cellules ES indifférenciées et au cours de la différenciation neuronale, par immunoprécipitation de la chromatine couplée à un séquençage à haut débit (ChIP-seq) et à une analyse bio-informatique. -d?identifier les gènes cibles de ATAC et leurs rôles dans les cellules ES et lors de la différenciation cellulaire en utilisant une approche de « knockdown » couplée à une étude transcriptomique. -d?identifier les voies de signalisation, les réseaux et les n?uds régulés par les complexes ATAC, de les comparer aux voies régulées par un autre complexe HAT, SAGA, afin de comprendre leurs fonctions dans la différenciation cellulaire. Ces analyses seront réalisées grâce à l?utilisation de techniques et d?outils récents de bioinformatiques à grande échelle. -Ce projet est rendu possible grâce aux compétences complémentaires des partenaires pour la biologie moléculaire, la recherche génomique et l?analyse bioinformatique ;