Synthèse de nouveaux nitroxides pour le diagnostic et l'étude de pathologie chez le petit animal via l'activité des protéases vue par IRM et effet Overhauser. – NITROMRI
Synthèse de nouveaux nitroxydes pour le diagnostic et l'étude de pathologie chez le petit animal via l'activité des protéases vue par IRM et effet Overhauser.
Aucune technique de spectroscopie non-invasive aussi efficace que l’IRM et qui soit adaptée à l’étude de l’activité protéolityque existant au sein des tumeurs n’est disponible. <br />Ce projet a pour but de développer une technique d’IRM réhaussée par l’effet Overhauser (amplification du signal conventionnel) adaptée à l’étude de l’activité enzymatique in vivo.<br />
Développement d’une machine IRMO, de l’électronique et de l’informatique ainsi que la préapration de sondes radiclaires nécessaire au succès du projet.
IRM réhaussée par l’effet Overhauser: une nouvelle technique d’IRM<br />En 30 ans, l’IRM est devenue une des techniques d’imagerie NON-INVASIVE les plus puissantes pour étudier les processus biologiques ainsi que l’anatomie du corps humain. Grâce à cet outil, des avancées médicales fantastiques ont pu avoir lieu. Ces progrès ont soulevé de nouvelles questions dépassant les capacités actuelles de l’IRM. Le développement d’une nouvelle méthode d’IRM capable d’étudier les processus enzymatiques in vivo sera une incroyable percée tant dans le domaine technologique que pour la compréhension de phénomènes biologiques intimes et le suivi in situ de l’effet des médicaments. Le développement de l’IRM ré-haussée par l’effet Overhauser (IRMO) basée sur l’utilisation de d’agents polarisant spécifiques d’une activité enzymatique semble une voie des plus prometteuse. Ce projet a deux cibles –développer l’IRMO et préparer de nouveaux nitroxydes comme agents polarisants – pour un seul objectif : une nouvelle technique d’IRM, l’IRMO, permettant l’étude de processus enzymatique in vivo. Lorsque le potentiel de l’IRMO sera illustré par l’étude de processus enzymatique dans une souris, la technique sera adapter à l’humain ce qui exige un autre saut technologique.<br /><br />IRMO et nitroxydes<br />Une machine IRMO a été développée en combinant un IRM corps complet (forme en C) à 0.2 T avec une cavité pour Résonance Paramagnétique Electronique capable d’accueillir une souris sans que le champ magnétique de l’IRM en soit perturbé. Parallèlement, des nitroxydes (sondes radicalaires) ont été greffées sur de l’élastine, puis ingérée par la souris et digérée.<br />Pour des études plus abouties, de nouveaux nitroxydes ont été préparés en une quinzaine d’étapes.<br />
Synthèse de nitroxyde
L’objectif de la partie chimie est la préparation de nitroxydes dont les constantes de couplages hyperfins changent après hydrolyse d’un fragment peptidique attaché au nitroxyde. Ce changement doit se produire par une transformation chimique simple : protonation ou changement conformationnel. Avant toute tentative de greffage d’une chaine peptidique, des études RPE seront réalisées sur des modèles simples.
Plusieurs nitroxides protonables ont été préparés. Certains d’entr’eux avaient des modifications de constantes de couplage significatives en milieu acide sauf qu’ils n’étaient pas adaptés pour le greffage d’un peptide. ceux qui étaient adaptés au greffage montraient des caractéristiques RPE ne remplissant pas le cahier des charges.
Nous avons aussi préparé des nitroxydes à 5-chaînons ?-phosphorylés diversement fonctionnalisés. Des changements conséquents des constantes de couplage ont été observés lors de changements conformationnels dus à des modifications de l’encombrement stérique. Toutefois, ces changements n’ont pu être observés qu’en solvants organiques.
Au cours des 12 derniers mois, nous avons développé la synthèse de nitroxydes cycliques à 6-chaînons ?-phosphorylés.
Développement de l’IRMO
Une machine IRMO a été développée ainsi que les séquences de RMN nécessaires pour étudier in vitro et in vivo l’action de protéases. L’objectif principal était de réaliser des images réhaussées par l’effet Overhauser le plus rapidement possible afin d’éviter l’échauffement de l’échantillon et pour des études cinétiques fiables.
Etudes de la protéolyse
Afin de tester la machine d’IRMO, un peptide test d’élastine greffée de nitroxydes a été préparé. Ce système a été testé in vitro et in vivo. LA proteolyse par des élastase neutrophile a été étudiée in vitro et ex vivo, montrant d e srésultats très prometteur puisqu’une activité due à concentration d’enzyme de l’ordre du nanomolaire a pu être observée.
Une machine IRMO permettant d’étudier l’activité enzymatique in vivo au sein d’une souris a été développée. Le système a été modifié de sorte à être utilisables avec des nitroxyde ayant des figures de couplages différentes (3 ou 6 raies). Quelques activités enzymatiques telles que la protéolyse d’élastine marquée par des nitroxydes ont pu être étudiées par IRMO.
Un nouveau nitroxyde portant un groupement phosphorylés en position ? a été préparé en une quinzaine d’étapes.
La suite de ce projet aura pour but de d’appliquer l’IRMO à l’étude de l’activité enzymatique au sein d’organes. Cette technique permettra aussi de comprendre l’activité enzymatique normale et conduira au développement de nouveaux outils de diagnostiques ainsi qu’au suivi de la réponse thérapeutique de traitements anti-proteases.
A notre connaissance, aucune autre technique d’imagerie in vivo n’existe actuellement. Ainsi, la préparation de nitroxyde portant un peptide spécifique d’une enzyme est la prochaine afin de franchir l’étape susmentionnée.
Les numéros des articles correspondent à ceux cités en section E2.
Les articles 1,2 et 3 ont permis de confirmer le potentiel de la technique d’IRM ré-haussée par l’effet Overhauser pour l’étude in vivo de processus enzymatiques.
Les résultats obtenus durant NITROMRI ont permis d’appliquer le concept de Théranostique à une nouvelle famille de molécules actives (articles 4 et 6).
L’article 5 traite de l’effet cybotactique avec les nitroxydes ?-phosphorylés qui sont les molécules clés du projet. Ce fut un moyen de valoriser le financement obtenus.
1-Contexte scientifique et objectifs du projet : Depuis le séquençage exhaustif du génome, l?attention s?est tournée vers le fonctionnement du produit des gènes et en particulier vers l?étude des activités enzymatiques. Alors qu?il existe de nombreuses méthodes d?étude in vitro, nous ne connaissons aucune méthode capable de suivre une réaction enzymatique in vivo dans un organe profond. Avec plus de 500 représentantes dans le génome humain les protéases constituent une classe majeure d?enzyme La spécificité, le moment et le lieu d?action de la plupart d?entre elles sont encore inconnus. Cependant leur rôle central est démontré dans des processus physiologiques importants parmi lesquels on peut citer : l?inflammation, la coagulation, la fibrinolyse, le remodelage tissulaire. De même la présence et le rôle important des protéases ne fait aucun doute dans de nombreuses pathologies comme la mucoviscidose, l?emphysème pulmonaire, la polyarthrite rhumatoïde, les infections bactériennes, virales et parasitaires, la progression des tumeurs et des métastases, les pancréatites etc? La plupart de ces pathologies sont accompagnées d?une inflammation et/ou d?apoptose, deux situations dans lesquelles des protéases sont activées spécifiquement et localement. Actuellement, il n?existe aucune technique non-invasive capable de suivre la protéolyse dans les tissus profonds. Ceci est un obstacle au développement de méthodes de dépistage pour les maladies citées plus haut. Dès lors, ce projet a pour but de développer une méthode d'imagerie non-invasive, Imagerie par Résonance Magnétique (IRM), spécifique de l'activité protéolytique. Le développement se fera sur le petit animal, et à l'aide de modèles animaux de pathologies humaines. Cette technique sera d'un apport considérable pour le diagnostic et le suivi des traitements. De plus une telle méthode fournirait un outil nouveau et unique pour la compréhension des mécanismes d?activation et d?entretien de la protéolyse en fonction des évènements physiologiques et donc pour la recherche fondamentale sur les protéases. 2-Description du projet, méthodologie : Le projet consiste à développer une méthode d?observation de la protéolyse in vivo sur le petit animal en imagerie par résonance magnétique (IRM) exaltée par la polarisation dynamique nucléaire (PDN). L?IRM est choisie en raison de sa capacité à imager les tissus profonds, pour sa résolution et sa précision dans la localisation 3D. Le choix de développer une méthode utilisant la PDN est lié au besoin d?une sensibilité accrue et d?un contraste le plus élevé possible entre les tissus subissant la protéolyse et les autres. En ce qui concerne le gain en signal, les estimations théoriques permettent d?espérer un gain d?un facteur 100. Les premiers essais in vitro nous ont déjà permis d?atteindre un facteur 54. Le travail principal sera de concevoir et synthétiser des substrats peptidiques contenant un radical libre stable tels que l?action de l?enzyme libère le radical en changeant son spectre de résonance paramagnétique électronique (RPE). Après réglage de l?imageur selon les propriétés spectrales du radical non lié ce changement doit générer un fort contraste révélateur de la présence de l?enzyme active. Dans un premier temps des radicaux libres seront synthétisés. Ceux dont les propriétés spectrales varient suffisamment en passant de la forme liée à la forme libre seront attachés à des peptides choisis en fonction de la protéase cible. Ces réactifs de contraste seront alors utilisés pour faire des images en trois dimensions de l?activité enzymatique in vitro, ex vivo puis sur le petit animal. 3-Résultats attendus : Les domaines d?action des protéases étant très variés, les applications possibles le sont également. La méthode d?imagerie que nous nous proposons de développer pourra être appliquée dans trois grands domaines : le diagnostic (par exemple balance protéases/inhibiteurs dans la mucoviscidose ou la polyarthrite rhumatoïde ou détections précoces des protéases dans l?environnement tumoral), l?évaluation des traitement anti-protéases et la recherche fondamentale. L?étude in vivo de la protéolyse par IRM/PDN peut en effet devenir un outil inédit pour l?étude du rôle crucial des protéases au cours du développement par exemple ou de tout autre évènement physiologique impliquant des protéases dont le rôle est encore très mal connu.
Coordination du projet
L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.
Partenaire
Aide de l'ANR 0 euros
Début et durée du projet scientifique :
- 0 Mois