– IntegRal

La cytocinèse, ultime étape de la division cellulaire, commence en fin de télophase et se termine par la séparation des deux cellules filles. Son déroulement nécessite trafic vésiculaire et signalisation intracellulaire. La migration cellulaire de même nécessite signalisation et trafic, et les bases moléculaires de ce rapprochement apparement oiseux pourrait être la mobilisation au cours de ces deux évènements d'un même complexe composé de la GTPases Ral et de l'exocyste. Ral et l'exocyste sont montrés impliqués a la fois dans le trafic et la signalisation. Notre projet investigue comment la signalisation par les GTPases Ral, au croisement de la signalisation et du trafic, contrôle des étapes de la cytocinèse : RalA et RalB se comporte comme des « points de contrôle » de la complétion d'une d'étape pour autoriser le passage à la suivante. Notre projet se nourrit à deux sources : - nos observations montrant que les deux GTPases Ral RalA et RalB, via leur effecteur commun le complexe de l'exocyste, contrôlent chacune une étape différente de la cytocinèse. Le défaut de signalisation par RalA empêche la transition entre les étapes précoces et tardives de la cytocinèse et les cellules filles fusionnent pour donner une cellule binuclée. Le défaut de RalB n'entraîne pas l'apparition de cellules binuclées mais retarde dramatiquement l'abscission du pont qui relie les cellules filles ; - des cartes d'interactions centrées sur la voie Ral: les interactomes humains et drosophiliens de Ral et de l'exocyste obtenus par double-hybride, des protéines identifiées par spectrométrie de masse, des interactants génétiques lors d'un crible génétique chez la Drosophile. Les protéines Ral sont des effecteurs critiques de Ras dans ses fonctions physiologiques et oncogéniques mais rien n'est connu à leur propos au cours de la cytocinèse. Un de leurs effecteurs est l'exocyste, un complexe de 8 protéines permettant l'attachement de vésicules à la membrane plasmique. Il fournit des membranes dans des situations où une expansion de la membrane plasmique est nécessaire, comme en migration ou lors de l'abscission du pont en fin de cytocinèse. L'exocyste n'apporte pas que des membranes: il est impliqué dans la livraison de récepteurs transmembranaires à bon port (GLUT4, EGFR). Il transporte en outre, par liaison protéine-protéine directe, des exécuteurs de voies de signalisation (MAP4K4, TBK1, lors de la migration cellulaire, pour la survie cellulaire): l'exocyste apparaît comme un élément de la signalisation cellulaire où sa régulation se fait essentiellement par Ral. Notre projet se propose de parcourir l'ensemble de la cascade Ral-exocyste, en se donnant 3 objectifs : - identifier les activateurs de RalA et de RalB, et comprendre les informations relayés lors de la transduction par les GTPases Ral - identifier les protéines apportées par l'exocyste et les fonctions exécutées, Des questions découlent de ces questions : comment un même complexe, celui de l'exocyste, peut être en charge des fonctions différentes de RalA et de RalB ? Les reseaux mobilisées au cours de la cytocinèse sont-ils conservés dans les autres fonctions où RalA et de RalB ont des contributions spécifiques ? - établir un modèle dynamique du « Réseau Ral » qui permettrait de prédire les nœuds de régulation pour les différentes fonctions cellulaires de ces GTPases. Le projet se déroulera selon un va-et-vient entre une approche à haute résolution à petite échelle et une approche à grande échelle mais basse résolution : - les techniques de biologie cellulaire sur cellules fixes et cellules vivantes seront utilisées tout au long du projet pour déterminer les phénotypes à l'échelle de la cellule et des structures sous-cellulaires, et traquer les molécules d'intérêt dans le temps et l'espace cellulaire au cours de la cytocinèse, en conditions normales et perturbées. - L'approche à grande échelle utilisera une plate-forme de microscopie automatisé à haut débit au format 96-puits couplé à des dép