Contrôle spatio-temporel de la ségrégation des chromosomes – CHROMALIGN

La plupart des tumeurs solides possèdent un nombre anormal de chromosomes (aneuploidie), ce qui est causé par des défauts de la ségrégation des chromosomes. La recherche dans notre équipe est focalisée sur l'étude des mécanismes permettant la séparation équitable des chromosomes. Une fois que le fuseau mitotique bipolaire est assemblé, la plupart des mécanismes régulant ou contrôlant l'alignement des chromosomes opèrent au niveau du kinétochore. Bien que l'on connaisse déjà une dizaine de protéines kinases importantes pour ces mécanismes (Musacchio et Salmon, 2007), la cascade de signalisation située au kinétochore est peu comprise. La tomographie électronique a fourni une vue du kinétochore comparable à une toile d'araignée (Dong et al., 2007), constituée de plusieurs sites de faible affinité d'interaction avec les microtubules (Cheeseman et al., 2006), et la relation entre les différents acteurs de ce réseau commence à peine à émerger.Nous avons récemment contribué à cette question, en étudiant la régulation de Cenp-E, un moteur moléculaire situé au kinétochore. Cette kinésine est un acteur essentiel de l'alignement des chromosomes (Wood et al., 1997/ Schaar et al., 1997), et de la régulation du checkpoint (Abrieu et al., 2000/ Mao et al., 2003/ Weaver et al., 2003). Nous avons montré que l'auto-inhibition de Cenp-E est réversée par des phosphorylations dépendantes des kinases CDK1-cycline B et MPS1 (Espeut et al., 2008). L'étape suivante sera de comprendre si ces mécanismes sont conservés pour la forme humaine de Cenp-E et in vivo. Dans ce but, nous avons commencé à identifier les sites de phosphorylation sur Cenp-E par les kinases MPS1 et CDK1-Cycline B. Nous proposons maintenant de générer des mutants de phosphorylation de la forme entière de Cenp-E afin d'analyser leur motilité in vivo. Nous utiliserons également ces protéines mutantes pour reconstituer des extraits d'oeufs de Xenope déplétés de la protéine Cenp-E endogène. En parallèle, nous développerons les outils qui permettront d'étudier si ce mécanisme est conservé in vivo sur la forme humaine de Cenp-E. Ceci nécessitait de caractériser le consensus des sites de phosphorylation par la kinase MPS1, afin de prédire les sites de phosphorylation dépendants de MPS1 sur Cenp-E. Ainsi, nous avons déterminé la séquence consensus pour MPS1 et nous avons trouvé qu'elle est très proche de celle utilisée par la kinase PLK1. Cependant, nous avons trouvé que bien que Cenp-E puisse être phosphorylé par les deux kinases sur des sites communs, certains sites sont spécifiques de MPS1. Et ce sont précisément ces derniers sites qui régulent la motilité de Cenp-E in vitro (Gaussen et al., soumis).MPS1 est une kinase associée au kinétochore qui est essentielle à la fois pour l'alignement des chromosomes (Jelluma et al., 2008) et pour le checkpoint (Abrieu et al., 2001/ Stucke et al., 2002). Bien que l'on sache que cette kinase est hyperactive et hyperphosphorylée en mitose (Stucke et al., 2002), le mécanisme régulant ces phosphorylations est inconnu. C'est pourquoi nous avons entrepris une étude détaillée de la régulation de MPS1 par phosphorylation. Ainsi, nous avons identifié 11 sites de phosphorylation sur MPS1 par spectromètrie de masse, et nous avons démontré que la phosphorylation d'un nouveau site sur MPS1 est essentielle à son activité (Morin, Abrieu, non publié). De plus, l'introduction d'un acide aminé mimant une phosphorylation à cette position reconstitue l'activité kinase MPS1. Nous cherchons maintenant à déterminer dans quelle mesure la phosphorylation de ces sites affecte 1) la localisation de MPS1 au kinétochore, 2) le recrutement d'autres protéines, 3) l'alignement des chromosomes et/ou 4) l'activité du checkpoint.Ensemble, ces études révèleront de nouveaux mécanismes régulant l'alignement et la séparation des chromosomes, et devraient donc contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes conduisant à l'aneuploidie. En effet, les protéines que nous étudions font