– RMAT

Le système de surveillance de l'assemblage du fuseau mitotique, appelé checkpoint, intervient dans le contrôle de la transition métaphase-anaphase. Ce dispositif permet à la cellule d'inhiber le déclenchement de l'anaphase afin de donner assez de temps aux chromosomes et au fuseau pour s'assembler correctement. Cette inhibition est dûe en partie à l'activité de Mad2 et de BubR1, qui se fixent et inhibent Cdc20, un cofacteur de l'Anaphase Promoting Complex (APC). Lorsque le checkpoint est éteint (suite à l'attachement correct du dernier kinétochore au fuseau), Cdc20 est libéré et peut ainsi activer l'APC. L'APC entraîne ensuite la dégradation de Cycline B et Securine, et en conséquence la kinase Cdc2 est inactivée et les chromatides sœurs se séparent. Ainsi la cellule sort de mitose. Notre projet vise à mieux comprendre le fonctionnement du checkpoint, et surtout comment il est inactivé lorsque les chromosomes sont correctement attachés au fuseau. Notre approche est d'utiliser les atouts génétiques de la mouche Drosophila en combinaison avec la microscopie de cellules vivantes. Nous allons analyser in vivo le comportement des protéines clées (tels que Mad1, Mad2, BubR1, RZZ complexe, CenpE, Cdc20, Cycline B), marquées par les tags fluorescents, pendant le déroulement de la mitose normale, ou suite aux perturbations expérimentales. En particulier, nous allons tester l'hypothèse généralement admise pour l'extinction du checkpoint, selon laquelle appareil du checkpoint préalablement assemblé aux kinétochores est démantelé par le transport de Mad2 depuis les kinétochores le long de microtubules ( shedding en anglais). Nous proposons de suivre simultanément in vivo disparition de Mad2 et la dégradation de Cycline B (qui sert comme un marqueur in vivo de l'extinction du checkpoint), et ainsi voir si les cinétiques des deux protéines sont compatibles avec le modèle. Nous allons mesurer les changements relatifs aux kinetochores de Mad2 et son récepteur Mad1 en fonction de la progression mitotique, afin de déterminer si l'enlèvement de Mad1 contribue également à l'extinction du checkpoint. Nous allons également tester la contribution éventuelle de phosphorylations au niveau de Mad2 dans l'extinction du checkpoint. Nous allons effectuer une dissection mutationnelle de deux fonctions associées à BubR1. Nous allons examiner le rôle de Cenp-Meta (homologue présumé de CenpE chez la mouche) dans la régulation de l'activité de BubR1, et investiguer son rôle dans la dynamique du shedding de RZZ. Enfin, nous allons entamer une analyse génétique de Cdc20, tout cela dans le but de mieux comprendre le rôle de ces protéines dans la régulation de la transition métaphase-anaphase.