Microsystèmes analytiques à base d'aptamères : analyse in situ des toxines algales dans des échantillons environnementaux – MICRAPTOX

Certaines cyanobactéries d'eau douce synthétisent des toxines qui ont causé la mort de nombreux animaux et ont déjà eu un sévère impact sur la santé humaine engendrant des décès. Une des familles les plus dangereuses de toxines sont les microcystines qui sont susceptibles de promouvoir des tumeurs à partir de concentrations aussi faibles que 0,1 µg.L-1. Lorsque l'environnement leur est favorable, les cyanobactéries se développent massivement et forment des efflorescences, blooms, qui sont directement associés à l'eutrophisation des milieux aquatiques. La dose létale en injection intrapéritonale chez la souris varie de 50 à 70 µg/kg témoignant de leur très forte toxicité. La croissance rapide de ces blooms en fait un grave problème de santé publique car ces microorganismes contaminent aussi bien des retenues d'eau servant d'aires récréatives que des réservoirs d'eau potable. Leur surveillance est devenue nécessaire et des recommandations de l'OMS indiquent une concentration seuil de l'ensemble des hépatotoxines de 1 µg/L. Les tests de toxicité sur souris sont encore grandement utilisés mais présentent de très faibles sensibilités. L'analyse de ces toxines par LC/MS apparait performante mais elle n'est pas applicable sur le terrain et reste difficile, longue et couteuse. A cet effet, les immuno-essais de type ELISA et les tests d'inhibition des phosphatases peuvent être utilisés. Cependant, les tests ELISA, par une réactivité croisée mal contrôlée sont sujets à des faux positifs lors du diagnostique tout comme les tests phosphatases qui peuvent réagir avec d'autres toxines présentant le même mode d'action. Enfin, ces deux tests sont très sensibles aux effets de matrice. Le développement d'une nouvelle approche est nécessaire afin d'améliorer les performances des outils analytiques pour le suivi et la surveillance des microcystines dans les milieux d'intérêt. L'analyse doit être simple, rapide et peu couteuse et pouvoir être réalisée in-situ pour que la prise de décision en cas de risque sanitaire grave tel qu'une intoxication d'une aire récréative soit quasiment immédiate. Nous nous proposons dans ce projet de valoriser l'utilisation d'aptamères pour la mise au point de tests de terrain miniaturisés. Les aptamères sont des acides nucléiques sélectionnés par une technique in vitro vis-à-vis de composés cibles (méthode SELEX). Ils sont capables de fixer leurs cibles avec une très haute affinité, égale ou supérieure à celle des anticorps. De fait, leur utilisation en tant qu'éléments de reconnaissance dans les techniques bioanalytiques constitue une alternative très intéressante par rapport aux approches immunologiques conventionnelles. A l'heure actuelle, les aptamères n'ont jamais été exploités pour des applications environnementales. Ces outils de diagnostics permettront d'évaluer immédiatement sur le site, les teneurs en microcystines toxiques dans des eaux concernées. Leur miniaturisation permettra d'avoir des systèmes transportables, rapides et conduira à une diminution de la quantité de bioréactifs analytiques nécessaires. Comme certaines microcystines ne sont pas toxiques, cette approche combinera un bioessai utilisant des aptamères (type ELONA) pour détecter les microcystines dans des échantillons réels (eau, extraits d'algues…) et un test de toxicité basé sur l'inhibition de phosphatases. Afin d'éviter tout effet de matrice, une étape de traitement d'échantillon basé également sur l'utilisation d'aptamères à large spectre sera réalisée in-situ en amont des bioessais. Le diagnostic rapide de la présence de microcystines toxiques sera ensuite confirmé au laboratoire par analyse en nanoLC/MS dont le potentiel sera augmenté par une étape de traitement de l'échantillon sélectif par l'intégration en ligne d'un support à base d'aptamères. Différentes étapes seront nécessaires: 1) Identifier les aptamères par la méthode SELEX 2) Les caractériser en termes d'affinité et de spécificité avant et après immobilisation sur support solide par des techniques variées et évaluer ainsi l'influence de l'étape d'immobilisation 3) Développer, à partir des aptamères sélectionnés, des bioessais en phase homogène ou hétérogène sur microplaques 4) Adapter le bioessai à base d'aptamères, le test phosphatase et l'étape d'extraction sélective à des systèmes sur puce pour l'analyse in situ 5) Valider l'analyse sur puce avec l'association de l'étape d'extraction sélective associée aux bioessais 6) Développer une méthode par nanochromatographie associée à la spectrométrie de masse pour identifier et quantifier les microcystines présentes dans les échantillons positifs. Une étape d'extraction sélective par aptamères sera réalisée au préalable afin d'obtenir une sensibilité maximale. Ce projet interdisciplinaire nécessite la collaboration de plusieurs équipes spécialisées : (i) dans la méthode SELEX pour l'identification des aptamères (partenaire 2, INSERM 869) (ii) en chimie organique pour l'immobilisation des microcystines ou des aptamères sur des billes magnétiques (pour le SELEX), particules de silice (pour les bioessais et supports d'extraction sélectifs)… (partenaire 1, UMR 5063 CNRS) (iii) dans les sciences analytiques pour leur caractérisation (partenaires 1 et 3, UMR 7121 et 5063 CNRS) (iv) dans l'analyse environnementale de toxines pour le développement et la validation des outils d'analyse des microcystines en milieux complexes (partenaire 3, UMR 7121 CNRS). Résultats attendus : 1) Identification d'aptamères en série ADN biostables, possédant une affinité et une réactivité croisée à large spectre pour une application directe aux échantillons réels. 2) Développement de systèmes miniaturisés portables pour la détection rapide, à faible cout des microcystines toxiques. 3) Pour les échantillons positifs, identification et quantification des microcystines au laboratoire par un système d'extraction sélective (à base d'aptamères) intégré en ligne à une analyse par nanoLC/MS.